由于天然克服光譜串?dāng)_的能力以及高靈敏和無(wú)損傷的特性,基于光譜分離的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）定量檢測(cè)（spFRET）方法被公認(rèn)為是最有應(yīng)用潛力的活細(xì)胞定量FRET檢測(cè)技術(shù)。首先簡(jiǎn)要介紹FRET定量檢測(cè)方法以及國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展;其次重點(diǎn)介紹基于發(fā)射光譜線性分離（Em-unmixing）和基于激發(fā)發(fā)射光譜線性分離（ExEm-unmixing）的兩種定量FRET檢測(cè)技術(shù)的原理、發(fā)展進(jìn)程,并比較了這兩種檢測(cè)技術(shù)的穩(wěn)健性;最后對(duì)這兩種spFRET技術(shù)在活細(xì)胞FRET應(yīng)用中的潛在優(yōu)勢(shì)進(jìn)行展望。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)激光. 2020,47(02)北大核心EICSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：13 頁(yè)

【部分圖文】：

CTV、C5V、CVC、VCV、C+V和C32V+C的活HepG2細(xì)胞的發(fā)射光譜和激發(fā)發(fā)射光譜[62]。(a)不同F(xiàn)RET結(jié)構(gòu)的細(xì)胞熒光圖像。比例尺為10 μm;(b)細(xì)胞1與細(xì)胞2在Ex405和Ex436激發(fā)下的單位面積歸一化的發(fā)射光譜圖; (c)細(xì)胞1與細(xì)胞2在Ex436和Ex470激發(fā)下的單位體積歸一化的激發(fā)發(fā)射光譜圖

圖2為從不同SNR的細(xì)胞中測(cè)得的E與RC的統(tǒng)計(jì)結(jié)果[62],原始數(shù)據(jù)如表1[62]所示。對(duì)于RSN>9的細(xì)胞,兩種方法得到的E與RC值是一致的;對(duì)于3<RSN<9的細(xì)胞,兩種方法都能得到一致的E值,但是用IIem-spFRET方法得到的C5V的RC值是不穩(wěn)定的,而且VCV的RC值是不準(zhǔn)確的;對(duì)于RSN<3的細(xì)胞,用IIem-spFRET方法得到的C5V和CVC的RC值都不穩(wěn)定,而且VCV的E和RC值都與文獻(xiàn)值和期望值存在偏差。這些結(jié)果進(jìn)一步證明ExEm-spFRET方法的穩(wěn)健性優(yōu)于IIem-spFRET方法,尤其當(dāng)RSN<3時(shí)。雖然很高的FPs表達(dá)水平有利于提高SNR,但是隨機(jī)碰撞有可能導(dǎo)致高估E值。例如,在共表達(dá)未連接C和V的細(xì)胞1中,自由的供體和受體有很高的表達(dá)水平,此時(shí)E值仍然不為零(約為0.07),這很可能是因?yàn)楣w分子和受體分子在細(xì)胞內(nèi)是隨機(jī)碰撞的,因此,進(jìn)行定量FRET測(cè)量時(shí)不應(yīng)選擇那些特別亮的細(xì)胞。ExEm-spFRET方法測(cè)得的VCV的RC值略高于期望值(表1),可能是因?yàn)槟Ｐ唾|(zhì)粒VCV的E值比較大(>0.66),460～500 nm波段內(nèi)激發(fā)發(fā)射光譜信號(hào)非常微弱(供體熒光淬滅),所以兩種方法測(cè)得的VCV的RC值都存在偏差。表1 ExEm-spFRET方法和IIem-spFRET方法測(cè)得的細(xì)胞1和2的統(tǒng)計(jì)E值和RC值[62]Table 1 Statistical E and RC values in cell 1 and cell 2 measured by ExEm-spFRETand IIem-spFRET method[62] Construct Condition E RC ExEm-spFRET IIem-spFRET ExEm-spFRET IIem-spFRET RSN>9 0.04±0.01 0.04±0.01 0.94±0.03 0.95±0.03 CTV 9>RSN>3 0.04±0.01 0.04±0.01 0.92±0.03 0.94±0.05 RSN<3 0.02±0.01 0.02±0.01 0.91±0.04 0.98±0.12 RSN>9 0.47±0.02 0.47±0.02 1.00±0.03 1.05±0.05 C5V 9>RSN>3 0.45±0.01 0.45±0.01 0.98±0.03 1.04±0.14 RSN<3 0.42±0.02 0.41±0.02 0.95±0.07 0.98±0.20 RSN>9 0.41±0.02 0.42±0.02 0.52±0.01 0.44±0.05 CVC 9>RSN>3 0.40±0.01 0.40±0.01 0.53±0.01 0.46±0.06 RSN<3 0.41±0.02 0.40±0.02 0.49±0.01 0.46±0.29 RSN>9 0.69±0.02 0.69±0.03 2.27±0.16 2.25±0.24 VCV 9>RSN>3 0.67±0.02 0.66±0.02 2.28±0.08 3.12±0.50 RSN<3 0.70±0.02 0.64±0.03 2.31±0.02 4.28±1.37 RSN>9 0.04±0.01 0.03±0.01 0.73±0.22 0.76±0.23 C+V 9>RSN>3 0.04±0.02 0.03±0.02 0.81±0.22 0.85±0.23 RSN<3 0.04±0.01 0.01±0.01 0.83±0.48 0.83±0.52 RSN>9 0.23±0.05 0.23±0.05 0.67±0.13 0.76±0.18 C32V+C 9>RSN>3 0.23±0.04 0.23±0.05 0.70±0.13 0.68±0.21 RSN<3 0.22±0.06 0.22±0.06 0.66±0.19 0.63±0.23


本文編號(hào)：3101106