發(fā)布時間：2021-03-16 04:10

　　(S)-吲哚啉-2-羧酸作為高血壓治療藥物培哚普利的關(guān)鍵中間體,其生產(chǎn)效率和純度將直接影響下游藥物的價格和質(zhì)量。目前,高光學純的（S）-吲哚啉-2-羧酸主要由化學法制備,但此類方法所需的手性助劑價格昂貴、難以回收,增加工業(yè)生產(chǎn)成本的同時還對環(huán)境造成了一定的壓力。而國內(nèi)外通過生物酶法制備（S）-吲哚啉-2-羧酸的報道較少,本實驗室從自然環(huán)境中篩選到了一株能立體選擇性拆分（R,S）-吲哚啉-2-羧酸乙酯的菌株Bacillus aryabhattai B8W22,本課題是在此基礎(chǔ)上從該菌株中分離純化出具有立體選擇性的酯酶,并構(gòu)建基因工程菌,優(yōu)化其工業(yè)催化條件,以期可以大規(guī)模生產(chǎn)（S）-吲哚啉-2-羧酸,主要研究結(jié)果如下:1.利用DEAE陰離子交換層析和辛基疏水作用層析,從Bacillus aryabhattai B8W22中純化出能手性拆分（R,S）-吲哚啉-2-羧酸乙酯的酯酶,酶的比活力從0.01U/mg增加到0.57 U/mg,純化倍數(shù)為59倍,產(chǎn)率為20%。MALDI-TOF鑒定顯示該蛋白為羧酸酯酶（WP＿013057000.1）,分子量為34705 Da,與SDS-PAGE電泳條帶大... 

【文章來源】：浙江工業(yè)大學浙江省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

(S)-吲哚啉-2-羧酸結(jié)構(gòu)式Figure1-1.Structuralformulaof(S)-indoline-2-carboxylicacid

阿耶氏芽孢桿菌酯酶的分離純化、基因克隆與表達及其應用研究17圖2-1酯酶分離純化電泳圖Figure2-1.Electrophoresismapofesterasepurification（A）Native-PAGE(8%)：第1、4泳道為粗酶液；第2、5泳道為DEAE陰離子交換層析純化的樣品；第3、6泳道為辛基疏水作用層析純化的樣品；泳道1、2、3進行銀染，泳道4、5、6進行酯酶活性染色。（B）SDS-PAGE（12%）：泳道M為蛋白marker26616；泳道1為辛基疏水作用層析純化的樣品；凝膠進行銀染。2.4.3蛋白質(zhì)譜鑒定使用MALDI-TOFMS（圖2-2）鑒定該蛋白為羧酸酯酶（WP_013057000.1）。其分子量為34705Da，與SDS-PAGE結(jié)果一致。這些結(jié)果表明從阿耶氏芽孢桿菌BacillusaryabhattaiB8W22中純化的酯酶是單體。圖2-2蛋白質(zhì)譜鑒定圖Figure2-2.Themapofproteinmassspectrumidentification

阿耶氏芽孢桿菌酯酶的分離純化、基因克隆與表達及其應用研究17圖2-1酯酶分離純化電泳圖Figure2-1.Electrophoresismapofesterasepurification（A）Native-PAGE(8%)：第1、4泳道為粗酶液；第2、5泳道為DEAE陰離子交換層析純化的樣品；第3、6泳道為辛基疏水作用層析純化的樣品；泳道1、2、3進行銀染，泳道4、5、6進行酯酶活性染色。（B）SDS-PAGE（12%）：泳道M為蛋白marker26616；泳道1為辛基疏水作用層析純化的樣品；凝膠進行銀染。2.4.3蛋白質(zhì)譜鑒定使用MALDI-TOFMS（圖2-2）鑒定該蛋白為羧酸酯酶（WP_013057000.1）。其分子量為34705Da，與SDS-PAGE結(jié)果一致。這些結(jié)果表明從阿耶氏芽孢桿菌BacillusaryabhattaiB8W22中純化的酯酶是單體。圖2-2蛋白質(zhì)譜鑒定圖Figure2-2.Themapofproteinmassspectrumidentification


本文編號：3085382