目的:CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚的反向遺傳學(xué)中的到了廣泛應(yīng)用,但突變基因的表型觀察往往需要在突變魚系的F1中進(jìn)行,費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。LHX9作為L(zhǎng)IM家族的一種轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有廣泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺發(fā)育不良。本研究擬通過一種新的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),采用四條sgRNA對(duì)LHX9基因進(jìn)行VASA轉(zhuǎn)基因斑馬魚的基因敲除,以觀察該基因缺陷對(duì)斑馬魚性腺發(fā)育的影響。方法:利用新的CRISPR/Cas9技術(shù),設(shè)計(jì)四條針對(duì)斑馬魚LHX9基因3號(hào)外顯子的20bp的sgRNA,通過非克隆體外轉(zhuǎn)錄得到靶位點(diǎn)的四條sgRNA。將以上靶位點(diǎn)的四條sgRNA與Cas9核酸酶蛋白同時(shí)注射入單細(xì)胞期的斑馬魚胚胎內(nèi),利用PCR鑒定突變型類型和突變比例。通過對(duì)LHX9基因突變體的VASA轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行熒光觀察,發(fā)現(xiàn)LHX9基因缺陷的斑馬魚性腺發(fā)育的情況。結(jié)果:靶向Exon 3的四條sgRNA可成功編輯斑馬魚LHX9基因,敲除效率高達(dá)82%,Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生10種不同的移碼突變類型。通過該方法對(duì)VASA轉(zhuǎn)基因斑馬魚的LHX9基因進(jìn)行編輯,發(fā)現(xiàn)LHX9基因突變... 

【文章來源】：現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2020,20(01)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

四條sg RNA靶位點(diǎn)位置圖。

本項(xiàng)研究利用新的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，通過對(duì)斑馬魚胚胎同時(shí)注射四條針對(duì)某一靶基因的sg RNA，足以產(chǎn)生基因敲除效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在F0代獲得與純合F2代變異體相似的臨床表型。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，這項(xiàng)新的CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，基因敲除效率可達(dá)90%以上，產(chǎn)生幾乎完全外顯的表型，且毒性作用不明顯（胚胎畸形率<17%)[1]。不同基因的g RNA往往由于染色體結(jié)構(gòu)不同、未注釋的SNP、改變的起始位點(diǎn)或剪切位點(diǎn)等因素產(chǎn)生不同的靶向效率。有時(shí)，即便能夠靶向到特定的基因，非同源修復(fù)也會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)部分功能的等位基因而影響敲除效率[13]。與傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)一條sg RNA進(jìn)行打靶相比，這種方法使F0的敲除表型（null phenotype）接近純合F2代。此項(xiàng)技術(shù)可以在短期內(nèi)獲得與F2純合表型接近的變異體，在對(duì)未知功能基因進(jìn)行篩選中有及其廣泛的應(yīng)用前景。本項(xiàng)研究就是利用該技術(shù)，對(duì)VASA轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行了LHX9的基因敲除，以探究LHX9基因缺陷對(duì)斑馬魚性腺發(fā)育的影響。哺乳動(dòng)物的性腺發(fā)育開始于早期具有雙向分化潛能的性腺原基，在睪丸決定因子SRY基因的調(diào)控下，性腺原基發(fā)育成睪丸，分泌雄激素與抗繆勒試管激素，促使胚胎的雄性化發(fā)育，相反的，缺乏SRY基因的個(gè)體，胚胎發(fā)育則會(huì)向雌性化方向進(jìn)行[14,15]。這個(gè)過程中參與的基因目前已知的主要有SRY,SF1,SOX9[16]等。而LHX9作為L(zhǎng)IM同源家族的轉(zhuǎn)錄因子，目前所廣為人知的功能主要是參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，其在性腺發(fā)育過程中的研究并沒有被深入。有趣的是，2000年，birk[2]等在小鼠胚胎發(fā)育早期的泌尿生殖嵴中發(fā)現(xiàn)了LHX9基因的廣泛分布，而原始生殖細(xì)胞正是在泌尿生殖嵴處形成。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，LHX9可調(diào)控類固醇生成因子（SF-1）的表達(dá)；在敲除LHX9的小鼠體內(nèi)，性腺體細(xì)胞出現(xiàn)增殖障礙，雄性小鼠出現(xiàn)外生殖器的雌性化改變，提示該基因在性腺發(fā)育中起重要作用。

哺乳動(dòng)物的性腺發(fā)育開始于早期具有雙向分化潛能的性腺原基，在睪丸決定因子SRY基因的調(diào)控下，性腺原基發(fā)育成睪丸，分泌雄激素與抗繆勒試管激素，促使胚胎的雄性化發(fā)育，相反的，缺乏SRY基因的個(gè)體，胚胎發(fā)育則會(huì)向雌性化方向進(jìn)行[14,15]。這個(gè)過程中參與的基因目前已知的主要有SRY,SF1,SOX9[16]等。而LHX9作為L(zhǎng)IM同源家族的轉(zhuǎn)錄因子，目前所廣為人知的功能主要是參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，其在性腺發(fā)育過程中的研究并沒有被深入。有趣的是，2000年，birk[2]等在小鼠胚胎發(fā)育早期的泌尿生殖嵴中發(fā)現(xiàn)了LHX9基因的廣泛分布，而原始生殖細(xì)胞正是在泌尿生殖嵴處形成。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，LHX9可調(diào)控類固醇生成因子（SF-1）的表達(dá)；在敲除LHX9的小鼠體內(nèi)，性腺體細(xì)胞出現(xiàn)增殖障礙，雄性小鼠出現(xiàn)外生殖器的雌性化改變，提示該基因在性腺發(fā)育中起重要作用。圖4 胚胎發(fā)育6d的VASA轉(zhuǎn)基因斑馬魚熒光成像。


本文編號(hào)：3069551