【背景】嗜熱鏈球菌AR333是本實驗室從發(fā)酵乳中篩選出的一株高產(chǎn)活性胞外多糖乳酸菌�！灸康摹拷⑹葻徭溓蚓鶤R333高效電轉(zhuǎn)化體系�！痉椒ā客ㄟ^單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化電轉(zhuǎn)化條件�！窘Y(jié)果】嗜熱鏈球菌AR333最優(yōu)電轉(zhuǎn)化條件為甘氨酸濃度8.3g/L,OD₆₀₀為0.8,10%甘油（體積比）和0.5 mol/L蔗糖的電轉(zhuǎn)緩沖液,pIB184質(zhì)粒80 ng,電場強度14 kV/cm,0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl₂和20 mmol/L MgCl₂的LM17復蘇培養(yǎng)基,復蘇時間5 h�！窘Y(jié)論】在最優(yōu)電轉(zhuǎn)化條件下,嗜熱鏈球菌AR333電轉(zhuǎn)化效率達到3.68×10⁵ CFU/μg-DNA,比優(yōu)化前提高了14倍,實現(xiàn)了嗜熱鏈球菌AR333的高效遺傳轉(zhuǎn)化,為其功能解析和基因工程改造奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：微生物學通報. 2020,47(05)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

各因素交互作用對嗜熱鏈球菌AR333電轉(zhuǎn)化效率的影響

關(guān)于乳酸菌電轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化已有較多報道，但關(guān)于嗜熱鏈球菌的研究較少。由于菌株之間的差異，采用已有的電轉(zhuǎn)化方法對嗜熱鏈球菌AR333進行轉(zhuǎn)化的效果不理想。因此，本研究首先通過單因素試驗對嗜熱鏈球菌AR333的電轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(OD600為0.8)時電轉(zhuǎn)化效率最高，研究表明該時期細胞生長最旺盛、活力最高，對電擊造成的損傷修復能力強，且細胞壁結(jié)構(gòu)相對疏松，有利于電擊時孔洞的形成，從而使轉(zhuǎn)化效率較高[15]。洛雪等[10]培養(yǎng)嗜熱鏈球菌sp1.1至OD600為0.8時電轉(zhuǎn)化效率最高，與本研究結(jié)果一致。由于嗜熱鏈球菌AR333是革蘭氏陽性菌，細胞壁較厚，因此需在生長培養(yǎng)基中添加適當?shù)幕瘜W物質(zhì)來弱化其細胞壁合成，促使形成松散的細胞壁結(jié)構(gòu)，有利于外源DNA導入。甘氨酸是乳酸菌中最常用的細胞壁弱化劑[16-18]，在本研究中甘氨酸濃度為9 g/L時轉(zhuǎn)化效率最大。任婧等[18]在干酪乳桿菌LC2W中考察甘氨酸濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響，甘氨酸濃度與本研究結(jié)果相近。在其他電轉(zhuǎn)化條件相同的情況下，電轉(zhuǎn)化效率會受到外源質(zhì)粒濃度的影響[19]。本研究中轉(zhuǎn)化效率隨著質(zhì)粒濃度的增加先升高后降低，原因可能是質(zhì)粒濃度較低時，細胞未得到充分利用導致轉(zhuǎn)化效率偏低；而質(zhì)粒濃度較高時，細胞能吸收的質(zhì)粒過飽和，反而不利于轉(zhuǎn)化[20]。

電轉(zhuǎn)化是嗜熱鏈球菌最有效的轉(zhuǎn)化方法，但電轉(zhuǎn)化效率受細胞生長狀態(tài)、甘氨酸濃度、質(zhì)粒濃度、電轉(zhuǎn)緩沖液、復蘇培養(yǎng)基、復蘇時間和電場強度等因素的影響。通過對不同影響因素進行優(yōu)化分析，結(jié)果表明不同生長狀態(tài)的嗜熱鏈球菌AR333轉(zhuǎn)化效率存在明顯差異。在細胞生長初期，轉(zhuǎn)化效率隨著OD600的增大而逐步升高。在初始條件OD600為0.4時，電轉(zhuǎn)化效率為2.64×104 CFU/μg-DNA；當培養(yǎng)細胞至OD600為0.8時，轉(zhuǎn)化效率達到峰值，為8.3×104 CFU/μg-DNA；隨著細胞進一步生長，轉(zhuǎn)化效率呈下降趨勢(圖1A)。嗜熱鏈球菌AR333生長速度與甘氨酸濃度呈負相關(guān)，隨著甘氨酸濃度升高，細胞生長速率逐步降低；當甘氨酸濃度為15 g/L時，其生長受到明顯抑制(圖1B)，因此該濃度不適合嗜熱鏈球菌AR333感受態(tài)的制備。嗜熱鏈球菌AR333轉(zhuǎn)化效率隨甘氨酸濃度增加先上升后下降，當甘氨酸濃度為9 g/L時，轉(zhuǎn)化效率最大，達到8.6×104 CFU/μg-DNA(圖1C)，與對照相比提高了18.6倍，說明添加適當濃度甘氨酸有利于電轉(zhuǎn)化效率提高。加入不同濃度質(zhì)粒的嗜熱鏈球菌AR333感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率存在明顯差異，轉(zhuǎn)化效率隨添加質(zhì)粒濃度的增加先升高后降低，質(zhì)粒濃度增加到80 ng時，轉(zhuǎn)化效率達到峰值1.15×105 CFU/μg-DNA(圖1D)。電轉(zhuǎn)緩沖液中加入蔗糖或山梨醇等滲透保護劑時，嗜熱鏈球菌AR333轉(zhuǎn)化效率大幅度提高，說明加入滲透保護劑有助于增加其轉(zhuǎn)化效率。利用蔗糖作為保護劑的電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅱ獲得了最高轉(zhuǎn)化效率2.47×105 CFU/μg-DNA(圖1E)；電擊后加入0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的復蘇培養(yǎng)基Ⅱ，獲得了最高轉(zhuǎn)化效率(圖1F)；在一定范圍內(nèi)，復蘇時間越長，轉(zhuǎn)化效率越高，復蘇5 h時轉(zhuǎn)化效率達到最大2.58×105 CFU/μg-DNA，當復蘇超過5 h時，轉(zhuǎn)化效率逐步下降(圖1G)。在低電場強度條件下，嗜熱鏈球菌AR333轉(zhuǎn)化效率隨電場強度的增加而提高，當電場強度達到12.5 kV/cm時，轉(zhuǎn)化效率最高，為3.43×105 CFU/μg-DNA，但進一步增加電場強度時，轉(zhuǎn)化效率有所下降(圖1H)。

【參考文獻】：
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本文編號：3062609