【背景】嗜熱鏈球菌AR333是本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)酵乳中篩選出的一株高產(chǎn)活性胞外多糖乳酸菌�！灸康摹拷⑹葻徭溓蚓鶤R333高效電轉(zhuǎn)化體系�！痉椒ā客ㄟ^單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化電轉(zhuǎn)化條件�！窘Y(jié)果】嗜熱鏈球菌AR333最優(yōu)電轉(zhuǎn)化條件為甘氨酸濃度8.3g/L,OD₆₀₀為0.8,10%甘油（體積比）和0.5 mol/L蔗糖的電轉(zhuǎn)緩沖液,pIB184質(zhì)粒80 ng,電場強(qiáng)度14 kV/cm,0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl₂和20 mmol/L MgCl₂的LM17復(fù)蘇培養(yǎng)基,復(fù)蘇時(shí)間5 h。【結(jié)論】在最優(yōu)電轉(zhuǎn)化條件下,嗜熱鏈球菌AR333電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到3.68×10⁵ CFU/μg-DNA,比優(yōu)化前提高了14倍,實(shí)現(xiàn)了嗜熱鏈球菌AR333的高效遺傳轉(zhuǎn)化,為其功能解析和基因工程改造奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：微生物學(xué)通報(bào). 2020,47(05)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

各因素交互作用對嗜熱鏈球菌AR333電轉(zhuǎn)化效率的影響

關(guān)于乳酸菌電轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化已有較多報(bào)道，但關(guān)于嗜熱鏈球菌的研究較少。由于菌株之間的差異，采用已有的電轉(zhuǎn)化方法對嗜熱鏈球菌AR333進(jìn)行轉(zhuǎn)化的效果不理想。因此，本研究首先通過單因素試驗(yàn)對嗜熱鏈球菌AR333的電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(OD600為0.8)時(shí)電轉(zhuǎn)化效率最高，研究表明該時(shí)期細(xì)胞生長最旺盛、活力最高，對電擊造成的損傷修復(fù)能力強(qiáng)，且細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相對疏松，有利于電擊時(shí)孔洞的形成，從而使轉(zhuǎn)化效率較高[15]。洛雪等[10]培養(yǎng)嗜熱鏈球菌sp1.1至OD600為0.8時(shí)電轉(zhuǎn)化效率最高，與本研究結(jié)果一致。由于嗜熱鏈球菌AR333是革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁較厚，因此需在生長培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物質(zhì)來弱化其細(xì)胞壁合成，促使形成松散的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有利于外源DNA導(dǎo)入。甘氨酸是乳酸菌中最常用的細(xì)胞壁弱化劑[16-18]，在本研究中甘氨酸濃度為9 g/L時(shí)轉(zhuǎn)化效率最大。任婧等[18]在干酪乳桿菌LC2W中考察甘氨酸濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響，甘氨酸濃度與本研究結(jié)果相近。在其他電轉(zhuǎn)化條件相同的情況下，電轉(zhuǎn)化效率會受到外源質(zhì)粒濃度的影響[19]。本研究中轉(zhuǎn)化效率隨著質(zhì)粒濃度的增加先升高后降低，原因可能是質(zhì)粒濃度較低時(shí)，細(xì)胞未得到充分利用導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率偏低；而質(zhì)粒濃度較高時(shí)，細(xì)胞能吸收的質(zhì)粒過飽和，反而不利于轉(zhuǎn)化[20]。

電轉(zhuǎn)化是嗜熱鏈球菌最有效的轉(zhuǎn)化方法，但電轉(zhuǎn)化效率受細(xì)胞生長狀態(tài)、甘氨酸濃度、質(zhì)粒濃度、電轉(zhuǎn)緩沖液、復(fù)蘇培養(yǎng)基、復(fù)蘇時(shí)間和電場強(qiáng)度等因素的影響。通過對不同影響因素進(jìn)行優(yōu)化分析，結(jié)果表明不同生長狀態(tài)的嗜熱鏈球菌AR333轉(zhuǎn)化效率存在明顯差異。在細(xì)胞生長初期，轉(zhuǎn)化效率隨著OD600的增大而逐步升高。在初始條件OD600為0.4時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率為2.64×104 CFU/μg-DNA；當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞至OD600為0.8時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到峰值，為8.3×104 CFU/μg-DNA；隨著細(xì)胞進(jìn)一步生長，轉(zhuǎn)化效率呈下降趨勢(圖1A)。嗜熱鏈球菌AR333生長速度與甘氨酸濃度呈負(fù)相關(guān)，隨著甘氨酸濃度升高，細(xì)胞生長速率逐步降低；當(dāng)甘氨酸濃度為15 g/L時(shí)，其生長受到明顯抑制(圖1B)，因此該濃度不適合嗜熱鏈球菌AR333感受態(tài)的制備。嗜熱鏈球菌AR333轉(zhuǎn)化效率隨甘氨酸濃度增加先上升后下降，當(dāng)甘氨酸濃度為9 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最大，達(dá)到8.6×104 CFU/μg-DNA(圖1C)，與對照相比提高了18.6倍，說明添加適當(dāng)濃度甘氨酸有利于電轉(zhuǎn)化效率提高。加入不同濃度質(zhì)粒的嗜熱鏈球菌AR333感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率存在明顯差異，轉(zhuǎn)化效率隨添加質(zhì)粒濃度的增加先升高后降低，質(zhì)粒濃度增加到80 ng時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到峰值1.15×105 CFU/μg-DNA(圖1D)。電轉(zhuǎn)緩沖液中加入蔗糖或山梨醇等滲透保護(hù)劑時(shí)，嗜熱鏈球菌AR333轉(zhuǎn)化效率大幅度提高，說明加入滲透保護(hù)劑有助于增加其轉(zhuǎn)化效率。利用蔗糖作為保護(hù)劑的電轉(zhuǎn)緩沖液Ⅱ獲得了最高轉(zhuǎn)化效率2.47×105 CFU/μg-DNA(圖1E)；電擊后加入0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的復(fù)蘇培養(yǎng)基Ⅱ，獲得了最高轉(zhuǎn)化效率(圖1F)；在一定范圍內(nèi)，復(fù)蘇時(shí)間越長，轉(zhuǎn)化效率越高，復(fù)蘇5 h時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大2.58×105 CFU/μg-DNA，當(dāng)復(fù)蘇超過5 h時(shí)，轉(zhuǎn)化效率逐步下降(圖1G)。在低電場強(qiáng)度條件下，嗜熱鏈球菌AR333轉(zhuǎn)化效率隨電場強(qiáng)度的增加而提高，當(dāng)電場強(qiáng)度達(dá)到12.5 kV/cm時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，為3.43×105 CFU/μg-DNA，但進(jìn)一步增加電場強(qiáng)度時(shí)，轉(zhuǎn)化效率有所下降(圖1H)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]嗜熱鏈球菌胞外多糖生物合成的研究進(jìn)展[J]. 孔令慧,趙林森,夏永軍,張匯,艾連中,熊智強(qiáng).  食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào). 2019(02)
[2]利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化條件[J]. 韋云瑩,趙燕,莊金偉,李江,帕米拉·乃則木丁,陸祎晟,艾連中,熊智強(qiáng).  食品與發(fā)酵工業(yè). 2019(07)
[3]嗜熱鏈球菌的電轉(zhuǎn)化條件[J]. 洛雪,時(shí)旭,史海粟,杜阿楠,陳茜,烏日娜,武俊瑞.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2019(06)
[4]響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化效率研究[J]. 韋云瑩,王立峰,熊智強(qiáng),王世杰,趙林森,艾連中.  上海理工大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(06)
[5]短小芽孢桿菌遺傳操作系統(tǒng)的建立及應(yīng)用[J]. 王超,賀婷婷,宋婷,張長斌,王海燕.  四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2017(05)
[6]保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌相互作用的研究進(jìn)展[J]. 黃艷娜,游春蘋,劉振民.  乳業(yè)科學(xué)與技術(shù). 2016(06)
[7]高滲提高凝結(jié)芽孢桿菌P4-102B菌株的電擊轉(zhuǎn)化效率[J]. 趙春云,楊頌,歐陽立明,王永紅.  微生物學(xué)通報(bào). 2016(06)
[8]植物乳桿菌G63電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化[J]. 范璟,席雪冬,黃彥,崔中利.  食品科學(xué). 2016(03)
[9]干酪乳桿菌LC2W最優(yōu)電轉(zhuǎn)化條件的建立[J]. 任婧,李楠,陳臣,董懿櫻,劉振民.  食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào). 2014(04)
[10]乳酸菌胞外多糖腸道黏附及免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J]. 李超,王春鳳,楊桂連.  食品科學(xué). 2014(11)

碩士論文
[1]人Ⅲ型膠原蛋白肽在嗜熱鏈球菌中的高效表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化[D]. 張波.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 2015
[2]質(zhì)粒pMG36e電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌的研究[D]. 楊子萱.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號：3062609