發(fā)布時間：2021-03-04 00:07

　　鱗翅目昆蟲種類繁多,遺傳多樣性極高,通過基因編輯對其基因功能進(jìn)行研究,解析其遺傳及生理生化調(diào)控機(jī)理是一種高效實(shí)用的方法。鱗翅目昆蟲基因編輯技術(shù)主要有3種:鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases,ZFNs）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases,TALENs）技術(shù)和CRISPR/Cas 技術(shù),其原理是在基因組特定位點(diǎn)制造 DNA 雙鏈斷裂,從而激活機(jī)體自身的 DNA 損傷修復(fù)機(jī)制,在此過程中產(chǎn)生插入、刪除等多種突變類型。就此3種主要基因編輯技術(shù)的原理及應(yīng)用于重要鱗翅目昆蟲如家蠶、斜紋夜蛾、棉鈴蟲等基因編輯研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述,為鱗翅目昆蟲功能基因組研究、昆蟲生理生化、昆蟲行為學(xué)研究及建立害蟲綠色防控體系提供參考。最后,對基因編輯技術(shù)在鱗翅目昆蟲中的應(yīng)用現(xiàn)狀做簡要總結(jié),對建立鱗翅目昆蟲適用的基因編輯技術(shù)及應(yīng)用前景進(jìn)行展望。 

【文章來源】：生物技術(shù)通報. 2020,36(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

ZFNs結(jié)構(gòu)及工作原理[5-6]

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶(TALENs)技術(shù)是第二代基因編輯技術(shù),TALENs來源于植物病原菌黃單胞菌屬(Xanthomonas),與ZFNs結(jié)構(gòu)相似,每一個TALENs由兩個功能域組成:N末端為TALE蛋白結(jié)構(gòu)域,特異性的結(jié)合DNA序列,C端為FokⅠ核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,非特異的切割靶位點(diǎn)造成雙鏈斷裂。每個TALE蛋白由3個部分組成:N-端轉(zhuǎn)運(yùn)信號;C-端核定位信號NLSs及酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD;中間DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。中間DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由多個串聯(lián)排列的重復(fù)序列單元組成,單個重復(fù)序列單元由33-35個高度保守的氨基酸組成,其中第12和13位氨基酸可變,被稱為重復(fù)可變雙殘基(Repeat-variable diresidue,RVD),RVD可特異的識別DNA堿基,其中NI識別A;NG識別T;HD識別C;NK識別G;NN識別G或A;NS識別A、C、G、T等,根據(jù)不同堿基序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的TALE模塊串,理論上可以靶向任何序列[7-8](圖2)。1989年,Bonas首次報道,2009年成功應(yīng)用于植物細(xì)胞基因組編輯[7],迄今已應(yīng)用于多種鱗翅目昆蟲基因編輯研究(表1)。2012年,Ma等[9]首次嘗試使用TALENs敲除家蠶BmBLOS2基因,通過顯微注射的方法,成功獲得BmBLOS2缺失突變個體。通過同時注射兩對TALENs,切割靶序列的兩個不同位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了家蠶基因組長片段刪除。為了提高其編輯效率,Takasu等[10]對TALENs系統(tǒng)進(jìn)行了進(jìn)一步的改造,利用改進(jìn)的TALENs系統(tǒng)pBlueTAL對家蠶BmBLOS2和Bm-re基因進(jìn)行敲除,編輯效率提高了一個數(shù)量級。2014年后,TALENs技術(shù)在家蠶基因編輯中的應(yīng)用快速發(fā)展,Xu等[11]利用TALENs對家蠶性別分化相關(guān)基因Bmdsx基因雌性特異外顯子進(jìn)行敲除,獲得了雌性不育遺傳系。日本科學(xué)家Sakurai和Yang等[12-13]利用TALENs分別對家蠶和亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)性信息素相關(guān)受體基因進(jìn)行基因敲除,缺失相關(guān)受體的個體出現(xiàn)交配行為異常。為了提高突變的精確性,Ma等[14]將TALEN技術(shù)與ssODN聯(lián)合注射到家蠶胚胎中,實(shí)現(xiàn)了家蠶染色體水平的精準(zhǔn)靶向編輯,制備了染色體缺失、重復(fù)、倒位等多個染色體結(jié)構(gòu)變異模型。將TALENs與微同源介導(dǎo)的末端連接原理結(jié)合,Nakade等[15]構(gòu)建了TAL-PITCh編輯器,成功在家蠶BmBLOS2基因位點(diǎn)插入GFP,該系統(tǒng)極大地提高了基因體內(nèi)標(biāo)記示蹤效率。迄今,利用上述TAL-PITCh編輯器已成功建立了家蠶W染色體示蹤品系及雌性W染色體特異表達(dá)Cas9穩(wěn)定遺傳品系[16]。TALENs技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用極大地推動了鱗翅目昆蟲基因編輯研究進(jìn)展。3 CRISPR/Cas技術(shù)及鱗翅目昆蟲基因編輯應(yīng)用

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)是第三代基因編輯技術(shù),不同于前兩代技術(shù),它是一種由RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶技術(shù),是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對外源核酸物質(zhì)攻擊所演化而來的獲得性免疫防御機(jī)制,由兩部分組成:CRISPR即規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),由前導(dǎo)序列(Leader)、重復(fù)序列(Repeat)和間隔序列(Spacer)組成;Cas 即 CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated system),其編碼核酸切割相關(guān)蛋白酶(圖3-A)。CRISPR/Cas免疫防御包括3個階段:接受(Adaptation),pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)表達(dá)和加工,干擾(圖3-B)。接受階段:外源核酸物質(zhì)首次入侵細(xì)菌基因組時,CRISPR系統(tǒng)會識別外源核酸中的PAM序列(Protospacer adjacent motif,原間隔序列臨近基序),并將其上游約 30 nt 的序列(原間隔序列Protospacer)剪切后插入自身CRISPR 陣列中的兩段重復(fù)序列之間(Repeat),形成新的 Spacer,獲得免疫記憶。pre-crRNA合成與加工階段:當(dāng)外源核酸物質(zhì)再次入侵細(xì)菌基因組時,在前導(dǎo)序列(Leader)的作用下起始轉(zhuǎn)錄CRISPR,得到的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CRISPR RNA(Pre-crRNA)在相關(guān)Cas核酸酶的作用下被加工成成熟的crRNA。干擾階段:成熟的crRNA 與相關(guān) Cas 蛋白形成復(fù)合體,通過堿基互補(bǔ)配對,crRNA識別外源核酸物質(zhì)中protospacer序列,引導(dǎo)Cas蛋白復(fù)合物對外源核酸進(jìn)行切割,造成雙鏈斷裂,從而防止外源核酸入侵[20-21]。95%的古細(xì)菌及48%的細(xì)菌其基因組中至少存在一個CRISPR基因座,具有極高的物種特異性和多樣性,不同菌種識別的PAM序列和Cas蛋白的數(shù)量及類型不同�；贑as蛋白結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為2個大類、6種類型及多種亞型(圖3),其中應(yīng)用較為廣泛的有Cas3(Type I)、Cas9(Type II)、Cas10(Type III)、Csf1(Type IV)、Cpf1/Cas12(Type V)、Cas13(Type VI)[20-22]。2012年,Jinek等[23]首次證明改造后的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以用于DNA體外靶向切割。Cas9 是Cas蛋白中重要的一員,CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)是細(xì)菌II型獲得性免疫防御系統(tǒng)經(jīng)人工改造而成,由Cas9蛋白、pre-crRNA(cr-RNA前體)和tracrRNA(Trans-activating crRNA)3個組分組成,pre-crRNA與tracrRNA結(jié)合,經(jīng)加工成成熟的發(fā)夾結(jié)構(gòu)cr-RNA;cr-RNA通過互補(bǔ)配對的方式引導(dǎo) Cas9 蛋白對靶序列進(jìn)行切割,造成DNA雙鏈斷裂,啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制,在雙鏈切口位點(diǎn)附近造成刪除、插入等多種隨機(jī)突變。


本文編號：3062192