生物系統(tǒng)的復(fù)雜性為生物元器件的構(gòu)建提出了挑戰(zhàn),新型控制元件的發(fā)現(xiàn)和穩(wěn)定可調(diào)節(jié)的元件設(shè)計(jì)成為合成生物學(xué)的重要內(nèi)容之一。終止子作為基因元件獨(dú)立于編碼基因行使終止轉(zhuǎn)錄的功能,是一種重要的合成生物學(xué)控制元件。研究表明終止子作用有強(qiáng)有弱,終止子的選擇會(huì)直接影響mRNA的量,并且隨著終止子結(jié)構(gòu)與功能的逐漸清晰和對(duì)轉(zhuǎn)錄終止機(jī)理的深入解析,以短小、可控、可設(shè)計(jì)為特征的終止子工程得以快速發(fā)展。本文以常規(guī)釀酒酵母為基礎(chǔ),系統(tǒng)總結(jié)了釀酒酵母中終止子元件在結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)、功能表征、轉(zhuǎn)錄終止機(jī)理方面的最新研究進(jìn)展,并討論了終止子的人工設(shè)計(jì)及在途徑工程精細(xì)調(diào)控領(lǐng)域的應(yīng)用情況,展望了終止子工程面臨的挑戰(zhàn)、可能的解決途徑及在非模式酵母中發(fā)展的潛力和意義。這為研究人員開發(fā)合成生物學(xué)元件和異源合成途徑優(yōu)化提供了科學(xué)的理論參考。 

【文章來源】：合成生物學(xué). 2020,1(06)

【文章頁數(shù)】：13 頁

【部分圖文】：

釀酒酵母終止子的基本結(jié)構(gòu)與表征方法[13]

終止子通過切割因子IA、切割因子IB識(shí)別自身效率元件和位置元件進(jìn)行3′末端的加工和切割。而多聚腺苷酸化反應(yīng)首先由切割因子IB和CPF蛋白質(zhì)復(fù)合物識(shí)別終止子元件上的ploy(A）位點(diǎn)及圍繞ploy(A）位點(diǎn)的富U/GU區(qū)域進(jìn)行切割，在多聚腺苷酸聚合酶的催化下，3′末端會(huì)合成具有一定長度的ploy(A）尾巴，將m RNA從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中翻譯成蛋白質(zhì)[55-57]。切割因子IA、IB的亞基根據(jù)其不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和裸露在外的氨基酸殘基行使不同的功能，結(jié)合不同的終止子區(qū)域（圖2）。突變或過表達(dá)切割因子IA、IB均會(huì)造成轉(zhuǎn)錄終止缺陷，但并不會(huì)完全停止轉(zhuǎn)錄。同樣，終止子的缺失可能延長轉(zhuǎn)錄過程造成下游基因的通讀，導(dǎo)致目標(biāo)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量的減少[58-59]。遺傳和功能研究表明轉(zhuǎn)錄終止因子與RNA的精確結(jié)合對(duì)于3′末端轉(zhuǎn)錄終止有巨大作用，在當(dāng)前的釀酒酵母轉(zhuǎn)錄終止因子研究中，僅有非編碼蛋白Nrd1、Nab3在全基因組上的靶標(biāo)RNA序列研究較為清楚，分別識(shí)別UGUAG/A和UCUUG[60-62]。另外，目前已確認(rèn)轉(zhuǎn)錄終止因子Pcf11、Rtt103、Mbp1、Fkh1主要作用于聚腺苷酸化反應(yīng)，但它們?nèi)绾闻c終止子結(jié)合行使終止功能還不完全清楚[63-66]。在上述轉(zhuǎn)錄終止因子中，發(fā)現(xiàn)切割因子IB家族包含的轉(zhuǎn)錄終止因子Pcf11與裂殖酵母、哺乳動(dòng)物、人、果蠅等中都含有類似的功能同系物，并貫穿于整個(gè)轉(zhuǎn)錄終止過程，推測Pcf11具有多種功能[67-71]。第一，Pcf11能夠識(shí)別終止子區(qū)域上的位置元件，利用自身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域招募蛋白質(zhì)因子Clp1、Rna14、Rna15和切割與多聚腺苷酸化因子CPF共同完成3′末端加工過程，同時(shí)促進(jìn)新生pre-RNA鏈從DNA-RNA-RNA復(fù)合物中釋放，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止[72-73]。第二，Pcf11介導(dǎo)與ploy(A）位點(diǎn)相關(guān)的切割和多聚腺苷酸化反應(yīng)，在ploy(A）位點(diǎn)處完成切割并添加ploy(A）尾巴，促進(jìn)m RNA成熟，并與非編碼RNA結(jié)合切割內(nèi)含子連接外顯子，構(gòu)建不同長度的轉(zhuǎn)錄本[74-75]。第三，在轉(zhuǎn)錄延伸過程進(jìn)行到3′末端時(shí)，Pcf11蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)與RNAP II Rbp1亞基CTD區(qū)域中磷酸化的Ser2、Ser5結(jié)合，促進(jìn)m RNA切割、RNAP II從DNA模板鏈上的解離，開啟下一輪轉(zhuǎn)錄[76-79]�？傊D(zhuǎn)錄終止因子Pcf11通過識(shí)別終止子元件，參與m RNA3′末端的加工和聚腺苷酸化反應(yīng)，既能影響轉(zhuǎn)錄終止的時(shí)機(jī)又能調(diào)控m RNA的穩(wěn)定性，對(duì)轉(zhuǎn)錄過程具有全局調(diào)控作用，是一種重要的潛在全局調(diào)控元件。然而，目前對(duì)其具體的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制還不清楚，特別是關(guān)于Pcf11是如何與終止序列識(shí)別并響應(yīng)的、它的靶標(biāo)RNA如何、Pcf11是如何參與聚腺苷酸化反應(yīng)進(jìn)行poly(A）的位點(diǎn)選擇的。相信通過構(gòu)建轉(zhuǎn)錄終止因子Pcf11等缺失菌株，利用高通量方法深入分析轉(zhuǎn)錄終止因子與終止子的結(jié)合位點(diǎn)和規(guī)律，將會(huì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)在全基因組層面分析轉(zhuǎn)錄終止過程的詳細(xì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為轉(zhuǎn)錄終止機(jī)理提供新的研究線索。

表達(dá)增強(qiáng)型終止子使釀酒酵母基因表達(dá)效率比對(duì)照提高了11倍，與不使用終止子情況相比提高了35倍，為今后終止子人工設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)和設(shè)計(jì)規(guī)則：如熒光蛋白的表達(dá)量與效率元件的序列長度成正比；位置元件和poly(A）位點(diǎn)對(duì)熒光蛋白的表達(dá)量沒有太大影響[104-105]。本課題組在優(yōu)化效率元件、位置元件和poly(A）位點(diǎn)基礎(chǔ)方面，進(jìn)一步探討了間隔區(qū)序列對(duì)終止子活性的貢獻(xiàn)。在Guo首次描述定義酵母終止所需最小元素集的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建266個(gè)長度約60 bp的人工終止子文庫，初步發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律：終止子活性隨效率元件與位置元件間Linker 1序列GC含量的升高而降低，且隨Linker 1序列中T的增加而增加；Linker 1序列GC含量對(duì)熒光蛋白表達(dá)量的影響要大于Linker 2序列；Linker 2序列構(gòu)成的莖環(huán)對(duì)不同活性終止子具有不同程度的影響，降低弱、中等強(qiáng)度終止子的莖長有利于提高m RNA表達(dá)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量[15,106]。這些研究充分證明終止子的活性是可以調(diào)節(jié)可以控制的，更短、最小序列的終止子可能被編入未來基因調(diào)控元件的設(shè)計(jì)和預(yù)測模型中，也將為理解終止子在基因表達(dá)調(diào)控中的作用提供重要信息。表1列舉了常用酵母終止子的相關(guān)信息。4 終止子在酵母途徑精細(xì)調(diào)控中的應(yīng)用

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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