DENN（Differentially Expressed in Normal cells and Neoplasia）結(jié)構(gòu)域是進(jìn)化上非常古老且高度保守的蛋白模塊,其本身具有鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors,GEF）活性。研究表明,具有DENN結(jié)構(gòu)域的蛋白常常作為Rab蛋白的GEF發(fā)揮作用,負(fù)責(zé)介導(dǎo)特定的Rab蛋白與GTP結(jié)合,使其變?yōu)榧せ顦?gòu)像,從而參與下游反應(yīng)。Rab是已知最大的單體GTPase家族,通過效應(yīng)蛋白調(diào)控細(xì)胞囊泡運輸和細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)等多種功能。FAM45A是一種非經(jīng)典型DENN家族蛋白,存在于阿米巴、海膽、多種昆蟲和脊椎動物等多種真核生物體內(nèi)且高度保守。我們前期研究表明,FAM45A是晚胞內(nèi)體/多囊泡體的調(diào)節(jié)因子,調(diào)節(jié)晚胞內(nèi)體的定位、成熟與分泌,但具體作用機制仍不明確。在本研究中,我們構(gòu)建了多種Rab蛋白的GTP/GDP鎖定突變體,利用免疫共沉淀和囊泡穩(wěn)態(tài)功能學(xué)回補實驗,發(fā)現(xiàn)FAM45A與多種Rab有相互作用,其敲降表型可被Rab27a/b的GTP鎖定突變體回補,說明FAM45A處于Rab27a/b的上游。其次,我們通過聯(lián)... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．胞內(nèi)體／溶酶體系統(tǒng)【１４］??ＩＬＶｓ，ＩＬＶｓ

ＤＥＮＮ結(jié)構(gòu)域蛋白ＦＡＭ４５Ａ調(diào)控囊泡運輸?shù)淖饔脵C制?引言??的貨物，并引導(dǎo)貨物的再循環(huán)。也有研究指出，ＰＩ（３）Ｐ的積累會導(dǎo)致ＷＡＳＨ復(fù)合??物被過量招募到胞內(nèi)體膜上，這對細(xì)胞正常的生命活動是不利的。而ＣＣＣ復(fù)合物??可以通過募集ＭＴＭＲ２（脂質(zhì)磷酸酶）來調(diào)節(jié)胞內(nèi)體膜上ＰＩ（３）Ｐ水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)??ＷＡＳＨ復(fù)合物的招募［｜｜］。??Ｅｎｄｏｓｏｍｅ?餐?Ｉ??ｌｕｍｅｎ?〇?■??Ａｃｔｉｎ?ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ?（?ＦＡＭ２１?）??ｙ??圖２．?ＣＣＣ復(fù)合物調(diào)節(jié)ＰＩ（３）Ｐ水平的機制糢擬圖［ｎ】??綜上所述，ＣＣＣ復(fù)合物自身可能作為一個連接橋梁，募集不同下游蛋白參與??調(diào)控多種貨物的再循環(huán)，也作為ＷＡＳＨ復(fù)合物募集水平的負(fù)調(diào)控因子。有意思的??是其組成成分中含有ＣＯＭＭ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)本身能二聚化，形成多種組合，很可??能可以識別不同的下游調(diào)節(jié)因子與貨物，但具體不同ＣＣＣ復(fù)合物如何調(diào)控不同的??囊泡運輸?shù)臋C制還不共了解。弄清ＦＡＭ４５Ａ與ＣＣＣ復(fù)合物的關(guān)系很可能對理解??ＣＣＣ復(fù)合物特異性調(diào)節(jié)囊泡運輸?shù)臋C制有枳極作用。??７??

反應(yīng)完成后在反應(yīng)的ＰＣＲ??管中直接加入Ｒａｂ７ａＸｈｏＩ＿Ｆ，?Ｒａｂ７ａＢａｍＨＩ＿Ｒ引物對，退火溫度６１°Ｃ，?ＰＣＲ主反??應(yīng)循環(huán)數(shù)設(shè)為３３。將ＰＣＲ產(chǎn)物，進(jìn)行ＤＮＡ電泳，切膠回收正確條帶，按前面的??方法進(jìn)行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選挑斑、測序步驟，得到由Ｃｉｔｒｉｎｅ標(biāo)記的Ｒａｂ７??（Ｑ６７Ｌ）表達(dá)載體。??Ｐ?，?Ｆｍ???＊??■啪?？???＂亡??：?????ＩＩＩ?ｐ?片段?Ｔ?＆?片段?ＴＴ??……ＬＬＣｒｒｉ???圖３．重疊延伸ＰＣＲ原理圖??重疊延伸ＰＣＲ引物：??Ｒａｂ７ａＸｈｏＩ?＿Ｆ?｜?５，－ＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧ－???３；???Ｒａｂ７ａＢａｍＨＩ?＿Ｒ?５，－ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴ????ｃ－ｒ???１９??


本文編號：3057346