脂肪酶是一種重要的工業(yè)用酶,廣泛應(yīng)用于化學(xué)品、食品、藥品、洗滌劑、紡織、皮革、新型材料、乳制品、化妝品、造紙、污染處理和生物能源等工業(yè)領(lǐng)域中。在這些脂肪酶中,細(xì)菌脂肪酶較其它來(lái)源的脂肪酶在水相、有機(jī)相中催化的反應(yīng)類型更多、反應(yīng)活性及穩(wěn)定性更高,其中又以假單胞菌屬（Pseudomonas）脂肪酶的性能最為優(yōu)越。雖然細(xì)菌脂肪酶具有諸多優(yōu)點(diǎn),但其產(chǎn)量普遍較低,常規(guī)育種方法難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的大量需求,因此市場(chǎng)價(jià)格昂貴、供不應(yīng)求。綜合文獻(xiàn)分析,可采用兩種策略提高細(xì)菌脂肪酶的表達(dá),即針對(duì)不依賴折疊酶或者較少依賴折疊酶的細(xì)菌脂肪酶基因（如:熒光假單胞菌脂肪酶基因）,采用異源表達(dá)的途徑提高脂肪酶的產(chǎn)量;對(duì)于對(duì)折疊酶有較強(qiáng)依賴性的細(xì)菌脂肪酶（如:銅綠假單胞菌脂肪酶）,則通過(guò)研究其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制來(lái)提高脂肪酶的表達(dá)量。為此,本論文以假單胞菌屬脂肪酶為研究對(duì)象,對(duì)上述兩個(gè)方面均做了有益探索,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果摘要如下:1.在異源表達(dá)路徑中,本研究以熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）Pf0-1的預(yù)測(cè)脂肪酶基因Pflip1為研究對(duì)象,分別將其在大腸桿菌和畢赤酵母中異源表達(dá),獲得對(duì)應(yīng)... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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經(jīng)典的α/β水解酶折疊子[1]

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文4理化性質(zhì)的深入研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪酶具有獨(dú)特的化學(xué)選擇性、位置選擇性和立體選擇性，不要求輔助因子，且可以在微生物中高效表達(dá)[2]。因此，它們具有極大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)化學(xué)品、藥品、洗滌劑、食品和乳制品中[32,33]。圖1.2脂肪酶的催化機(jī)制[1]Fig.1.2Thecatalyticmechanismoflipase[1]1.3.1脂肪酶在清潔劑工業(yè)的應(yīng)用脂肪酶商業(yè)化應(yīng)用需求較大的一個(gè)領(lǐng)域就是它作為洗滌劑的添加物，居民家庭清潔和工業(yè)部門的洗滌需求對(duì)于這類酶有極大的需求[34]。為了提高脂肪酶在洗滌工業(yè)的表現(xiàn)，遺傳操作手段應(yīng)用于改善脂肪酶的酶學(xué)性能，在1994年，NovoNordisk公司首先引入了商業(yè)化的脂肪酶Lipolase，它是來(lái)源于真菌T.lanuginosus并且在A.oryzae中異源表達(dá)的脂肪酶[35]。由于洗滌工業(yè)通常處于堿性環(huán)境，篩選耐堿性的脂肪酶是首要考慮的因素，人們發(fā)現(xiàn)源于Acinetobacterradioresistens的堿性脂肪酶在pH=10時(shí)具有最大活性，并且在pH處于6-10之間具有很高的穩(wěn)定性，極大提高了脂肪酶的應(yīng)用價(jià)值[36-38]。

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文12聯(lián)到特異的啟動(dòng)子元件，激活或者抑制下游蛋白的表達(dá)[85-87]。在銅綠假單胞菌中，存在兩種群體信號(hào)分子，LasI/R和RhlI/R系統(tǒng)[88-92]。在兩種系統(tǒng)中生成的胞外信號(hào)分子是�；呓z氨酸內(nèi)酯。當(dāng)其偶聯(lián)上同源蛋白LasR或者RhlR時(shí)，許多下游基因被激活，這些基因可編碼許多胞外酶和毒性因子，例如脂肪酶、堿性蛋白酶、彈性蛋白酶、外毒素A和胞外酶S。另外，細(xì)菌的蠕動(dòng)、膜的形成和鼠李糖脂的生產(chǎn)都受到這個(gè)機(jī)制的調(diào)控[93,94]。因?yàn)镼S系統(tǒng)是一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都發(fā)揮相應(yīng)調(diào)節(jié)作用，并且它受到全局調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，這個(gè)系統(tǒng)在本文中不做深入討論[94]。有關(guān)于脂肪酶表達(dá)的研究，RhlI/R系統(tǒng)可間接調(diào)節(jié)脂肪酶的表達(dá)[69]。鑒別了處于lipAH操縱子上游σ54依靠的啟動(dòng)子序列后，利用Tn5轉(zhuǎn)座子技術(shù)篩選出了二元調(diào)控元件LipQ/R[95]。二元調(diào)控系統(tǒng)由一個(gè)傳感器蛋白激酶和一個(gè)應(yīng)答調(diào)控元件組成，展示了細(xì)菌適應(yīng)細(xì)胞濃度和環(huán)境因子的另外一類重要的調(diào)控機(jī)制[96]。環(huán)境因子可以誘導(dǎo)傳感器激酶組氨酸殘基的自磷酸化，之后磷酸化形態(tài)轉(zhuǎn)移到應(yīng)答元件的天冬氨酸殘基上，從而激活了目標(biāo)基因的表達(dá)[97,98]。圖1.3銅綠假單胞菌中脂肪酶基因的表達(dá)調(diào)控[69]。Fig.1.3RegulationoflipasegeneexpressioninP.aeruginosa[69].在銅綠假單胞菌的LipQ/R調(diào)控元件中，傳感器激酶LipQ似乎也能被轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RhlR激活，也可能是某種位置的環(huán)境信號(hào)，又或者是由于錯(cuò)誤折疊蛋白引發(fā)周質(zhì)發(fā)出的信號(hào)。激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LipR偶聯(lián)到上游激活序列（UAS），其來(lái)源于lipAH

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]帶His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在畢赤酵母中的表達(dá)及純化[J]. 汪小鋒,申旭光,趙鶴云,孫永川,紀(jì)昌濤,閆云君.  中國(guó)生物工程雜志. 2011(04)
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博士論文
[1]脂肪酶/酯酶的理性設(shè)計(jì)和改造研究[D]. 李冠霖.華中科技大學(xué) 2018
[2]立體選擇性脂肪酶在手性化合物拆分中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D]. 戴大章.浙江大學(xué) 2006
[3]脂肪酶催化拆分N取代苯基α氨基丙酸的研究[D]. 鄭良玉.吉林大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3043490