銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是條件致病菌,可引起多種急慢性感染。其急性感染主要依賴于細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和Ⅲ型分泌系統(tǒng)（typeⅢsecretion system,T3SS）,而慢性感染通常與生物被膜的形成有關(guān)。在銅綠假單胞菌中,Gac/Rsm通路已被證明參與調(diào)節(jié)細(xì)菌從急性感染到慢性感染的轉(zhuǎn)換過程。除Gac/Rsm通路外,細(xì)胞內(nèi)的第二信使環(huán)二鳥苷酸（cyclic di-GMP,c-di-GMP）在這一轉(zhuǎn)換過程中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明,銅綠假單胞菌基因組上編碼多個(gè)二鳥苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶,它們負(fù)責(zé)cdi-GMP的合成和降解,但這些酶如何實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性仍不清楚。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),含有GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的雜合c-di-GMP代謝酶PA0575的缺失可在不同時(shí)期顯著影響細(xì)菌生物被膜的形成。同時(shí)PA0575的缺失可上調(diào)T3SS的表達(dá),過表達(dá)PA0575則嚴(yán)重降低了T3SS的表達(dá)。我們推測,PA0575可能是調(diào)控銅綠假單胞菌急慢性感染過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。為了進(jìn)一步闡明PA0575在銅綠假單胞菌急慢性感染過程中的具體功能及調(diào)控機(jī)制,我們對PA0575... 

【文章來源】：西北大學(xué)陜西省 211工程院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Ⅲ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和調(diào)控模型[54]

第一章緒論5調(diào)控系統(tǒng)（圖1）。在cAMP途徑中，銅綠假單胞菌外部環(huán)境中的低濃度的鈣離子誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cAMP的增加，導(dǎo)致T3SS基因高水平的表達(dá)[61]。在Gac/Rsm系統(tǒng)中，LadS通過一系列磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)的方式激活Gac/Rsm系統(tǒng)（圖2），在慢性感染期間下調(diào)T3SS的表達(dá)[62-65]。而RetS通過與GacS結(jié)合形成異源二聚體，阻止了GacS自身的磷酸化，此時(shí)GacA下游直接調(diào)控的兩個(gè)microRNA（RsmY/RsmZ）轉(zhuǎn)錄水平降低，解除對結(jié)合蛋白RsmA的負(fù)調(diào)控。RsmA則間接正調(diào)T3SS基因的表達(dá)，同時(shí)負(fù)調(diào)生物被膜形成基因的表達(dá)及Ⅵ型分泌系統(tǒng)毒性因子的分泌[66]。MoscosoJA等人的研究顯示，在retS突變體中，c-di-GMP水平的升高導(dǎo)致T3SS表達(dá)的降低，同時(shí)上調(diào)Ⅵ型分泌系統(tǒng)（typeⅥsecretionsystem，T6SS）的表達(dá)以及生物被膜的形成[67]。此外Gac/Rsm系統(tǒng)可通過調(diào)控二鳥苷酸環(huán)化酶SadC的表達(dá)水平來發(fā)揮對生物被膜的部分調(diào)控作用[45]。以上這些研究表明，c-di-GMP信號途徑和Gac/Rsm系統(tǒng)可協(xié)同調(diào)控銅綠假單胞菌的急慢性感染轉(zhuǎn)換過程。除此之外，銅綠假單胞菌T3SS基因表達(dá)還受到多種因素的調(diào)節(jié)，比如代謝效應(yīng)、DNA損傷、細(xì)胞外高濃度的Cu2+，低滲透壓等[68]。圖2銅綠假單胞菌生活方式調(diào)節(jié)示意圖[67]Fig.2SchematicdiagramoflifestyleregulationofPseudomonasaeruginosa盡管有關(guān)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組成和調(diào)控機(jī)制的研究取得了很多的成果，但是目前還是存在一些疑問。在Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組成中，針狀復(fù)合體是最重要的組成部分，目前還不清楚細(xì)菌是如何控制這種針狀復(fù)合體延伸到適當(dāng)?shù)拈L度。如果針頭太短，它就不能穿過宿主細(xì)胞外膜上的脂多糖（LPS）層；如果針頭太長，輸送效應(yīng)蛋白的效率可能會(huì)降低

西北大學(xué)碩士學(xué)位論文22ddH2O6.6μL（3）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行消甲基化，37℃反應(yīng)1-2h，反應(yīng)體系：DpnⅠ0.2μLPCR產(chǎn)物10μL（4）去甲基化反應(yīng)后，將產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。（5）挑取長出的單克隆純化，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序分析。確定突變位點(diǎn)正確后，將定點(diǎn)突變后的重組質(zhì)粒分別命名為：pAK-0575ΔGGDEF、pAK-0575ΔEAL。2.2.9啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建本次實(shí)驗(yàn)基于已有的啟動(dòng)子報(bào)道質(zhì)粒pMS402構(gòu)建基因表達(dá)載體pKD-cbrB[73]，以下是詳細(xì)的構(gòu)建過程：圖3質(zhì)粒pMS402圖譜Fig.3TheplasmidmapofpMS402以PAO1的全基因組為模板，使用pKD-cbrB-S/pKD-cbrB-AS引物，用Pfu酶對目的基因cbrB的啟動(dòng)子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最終插入到pMS402質(zhì)粒上，經(jīng)驗(yàn)證正確后就得到了正確的表達(dá)載體pKD-cbrB。通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入到銅綠假單胞菌中，檢測該基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。除此之外，在重組構(gòu)建好的pKD質(zhì)粒中通過PacⅠ單酶切，與整合質(zhì)粒Mini-CTX-lacZ中得到CTX6.1連接后，能夠得到整合染色體上的報(bào)道載體，這樣做可以保證報(bào)道

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]銅綠假單胞菌生物被膜研究進(jìn)展[J]. 高珊,張哲倫,蘇杭,韓峰.  中國海洋藥物. 2018(05)

博士論文
[1]銅綠假單胞菌中Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究[D]. 孔偉娜.西北大學(xué) 2013



本文編號：3043349