氨基轉(zhuǎn)移酶（AT）由于能夠?qū)被D(zhuǎn)移到酮或酮酸中,并且具有高對(duì)映選擇性和區(qū)域選擇性,是用于合成手性氨基酸或者酮酸的重要生物催化劑。在所有的轉(zhuǎn)氨酶中,支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（BCAT）能可逆地催化支鏈氨基酸（BCAAs）,如L-纈氨酸,L-亮氨酸和L-異亮氨酸,與α-酮戊二酸生成相應(yīng)的酮酸和L-谷氨酸。目前,BCAT已應(yīng)用于包括L-叔亮氨酸在內(nèi)的非天然氨基酸及支鏈酮酸的生物合成。盡管BCAT具有巨大的潛力,但絕大多數(shù)的酶仍然缺乏廣泛的底物范圍和活性,因此研究新來(lái)源和新型酶具有很大的前景。本論文中,我們通過(guò)生物信息學(xué)的手段挖掘出4種不同來(lái)源的BCAT,并在大腸桿菌中進(jìn)行了克隆、表達(dá)及純化。在進(jìn)行了活性對(duì)比后,選擇了來(lái)源于假單胞菌來(lái)源的BCAT（PsBCAT）,進(jìn)一步對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析研究。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,PsBCAT的最適反應(yīng)pH、溫度及PLP濃度分別為8.5、40oC、10 mM。PsBCAT表現(xiàn)出相對(duì)較寬的底物譜,并且對(duì)L-亮氨酸,L-纈氨酸,L-異亮氨酸和L-苯丙氨酸具有顯著高的活性,活性分別為105 U/mg,127 U/mg,115 U/mg和98 U/mg。另... 

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【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 酮酸
        1.1.1 酮酸概述
        1.1.2 酮酸的應(yīng)用
        1.1.3 酮酸的合成
    1.2 手性氨基酸
        1.2.1 手性氨基酸概述及應(yīng)用
        1.2.2 手性氨基酸的合成
        1.2.3 L-叔亮氨酸
    1.3 轉(zhuǎn)氨酶
        1.3.1 轉(zhuǎn)氨酶概述
        1.3.2 支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶
    1.4 蛋白質(zhì)晶體學(xué)
        1.4.1 蛋白質(zhì)結(jié)晶原理
        1.4.2 蛋白質(zhì)結(jié)晶方法
    1.5 選題依據(jù)
    1.6 研究?jī)?nèi)容
    1.7 創(chuàng)新點(diǎn)
    1.8 技術(shù)路線
第二章 生物信息學(xué)及BCATs的克隆、表達(dá)與純化
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 BACT序列的網(wǎng)絡(luò)分析和高活性、新底物選擇性BCAT挖掘
        2.3.2 重組蛋白的表達(dá)純化
    2.4 小結(jié)
第三章 PsBCAT的酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 最適反應(yīng)pH的測(cè)定
        3.3.2 最適反應(yīng)溫度的測(cè)定
        3.3.3 PLP濃度對(duì)酶活性影響的測(cè)定
        3.3.4 底物特異性的測(cè)定
        3.3.5 動(dòng)力學(xué)測(cè)定
    3.4 小結(jié)
第四章 PsBCAT晶體結(jié)構(gòu)解析
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 蛋白質(zhì)結(jié)晶條件初篩結(jié)果
        4.3.2 蛋白質(zhì)結(jié)晶條件優(yōu)化結(jié)果
        4.3.3 晶體的整體結(jié)構(gòu)分析
        4.3.4 活性位點(diǎn)分析
    4.4 小結(jié)
第五章 合成L-叔亮氨酸
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 BsOrnAT的克隆、表達(dá)及純化
        5.3.2 PsBCAT催化合成合成L-叔亮氨酸
        5.3.3 偶聯(lián)生物系統(tǒng)催化合成L-叔亮氨酸
    5.4 小結(jié)
總結(jié)與展望
    總結(jié)
    展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]蛋白質(zhì)晶體學(xué)技術(shù)的發(fā)展與展望[J]. 李蘭芬,南潔,蘇曉東.  生物物理學(xué)報(bào). 2007(04)
[2]柱前衍生化-HPLC測(cè)定田參氨基酸膠囊中10種氨基酸的含量[J]. 錢廣生,蘇旭,劉三康,李章萬(wàn).  華西藥學(xué)雜志. 2005(02)

博士論文
[1]PHA顆粒結(jié)合蛋白的表達(dá)、結(jié)晶與X射線衍射分析[D]. 趙明蓮.清華大學(xué) 2005

碩士論文
[1]人線粒體天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶結(jié)晶及晶體結(jié)構(gòu)研究[D]. 王佳.大連理工大學(xué) 2016
[2]重組制備人細(xì)胞質(zhì)谷草轉(zhuǎn)氨酶及結(jié)晶條件研究[D]. 常海洋.大連理工大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3029177