短桿菌來源膽固醇氧化酶的重組表達(dá)及雜化納米花固定化研究
發(fā)布時間：2021-01-09 16:11
膽固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase,COD）是一種多功能生物酶,屬于黃素蛋白氧化還原酶,該酶是生物細(xì)胞代謝過程中膽固醇降解的重要酶,被廣泛應(yīng)用于臨床檢測,農(nóng)業(yè),食品檢測等領(lǐng)域。本研究將短桿菌Brevibacterium sp.來源的膽固醇氧化酶基因（cod）在大腸桿菌（Escherichia coli）中重組表達(dá),研究了其酶學(xué)性質(zhì);對重組酶進(jìn)行有機-無機雜化納米花固定研究,考察了COD對不同底物的轉(zhuǎn)化能力,并對產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。（1）以含有Brevibacterium sp.來源cod基因的質(zhì)粒pET28a-cod作為PCR模板,擴增cod基因,將其與質(zhì)粒pRhamTM連接,并在宿主E.coli BL21（DE3）菌株中進(jìn)行重組表達(dá)。使用7-氯-異咯嗪及黃素單核苷酸（FMN）為親和配體填料的純化柱進(jìn)行純化,獲得比酶活25.23 U·mg-1的純酶。酶學(xué)性質(zhì)測定顯示膽固醇氧化酶的最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)pH為7.0,經(jīng)差式掃描量熱分析（DSC）,得到酶半變性溫度為60.5℃。對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度為0.25%時,...
【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：65 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
膽固醇氧化酶催化過程
江南大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)合。漆酶通過共價結(jié)合的方式固定在功能化的 SBA-15 介孔二OMW 的四種酚類化合物的水溶液，而且 10 個反應(yīng)循環(huán)后仍有鎂土納米纖維作為支持材料與乙醇脫氫酶共價結(jié)合，底物的轉(zhuǎn)在 2 小時內(nèi)達(dá)到 88%和 99.2%，并且在 8 個循環(huán)后保留了約 4化方法具有所需時間較短、載體與酶分子不易分離等優(yōu)點。然需條件較為劇烈致使酶活損失較高，而且載體可能結(jié)合到酶活。，每種固定方法都存在優(yōu)點和缺點，選擇最合適的固定化技術(shù)的檢測模式。
江南大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章 結(jié)果與討論3.1 膽固醇氧化酶在大腸桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究3.1.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及驗證E. coli. BL21/pET-28a 構(gòu)建 COD 表達(dá)載體 pRhamTM-cod，構(gòu)建流程見圖 3-1。以質(zhì)粒pET28a-cod 作為模板，PCR 擴增膽固醇氧化酶基因 cod，擴增過程引入酶切位點 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ，如圖 3-2(a)，PCR 條帶大小與 cod 基因理論值相符，且條帶單一，PCR 結(jié)果良好。按照 2.2.3 方法得到重組質(zhì)粒 pRhamTM-T-cod，測序正確。重組質(zhì)粒 pRhamTM-cod獲得參考 2.2.4 方法，將獲得的質(zhì)粒采用 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ雙酶切，并通過核酸電泳進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果如圖 3-2(b)所示，可看出其顯示兩條明顯的條帶，目的條帶出現(xiàn)的位置分別與理論值 2575 bp 和 1524 bp 相符，證明重組質(zhì)粒 pRhamTM-cod 構(gòu)建成功。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Cu-MOFs固定化酶制備及染料降解應(yīng)用研究[J]. 高霞,張國春,喬成芳. 商洛學(xué)院學(xué)報. 2018(04)
[2]新型載體PEI修飾樹脂固定化脂肪酶及其在對2-氯丙酸酯拆分中的應(yīng)用[J]. 關(guān)鋒. 橡塑技術(shù)與裝備. 2016(06)
[3]比色法測定膽固醇氧化酶酶活[J]. 季文明,陳毅力,張和春,王武. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報. 2000(03)
[4]用膽固醇氧化酶脫除豬油中的膽固醇[J]. 江正強,沈再春,閻巧娟. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 1996(02)
碩士論文
[1]嗜熱玫瑰紅球菌肌氨酸氧化酶表達(dá)、結(jié)構(gòu)及功能研究[D]. 鄭夢玲.江南大學(xué) 2018
[2]CALB的固定化及其催化合成富含EPA/DHA甘油三酯的研究[D]. 劉向前.華南理工大學(xué) 2017
[3]固定化蛋白酶的制備及其在毛織物防氈縮整理中的應(yīng)用[D]. 鐘業(yè)桂.東華大學(xué) 2010
本文編號：2966986
【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：65 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
膽固醇氧化酶催化過程
江南大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)合。漆酶通過共價結(jié)合的方式固定在功能化的 SBA-15 介孔二OMW 的四種酚類化合物的水溶液，而且 10 個反應(yīng)循環(huán)后仍有鎂土納米纖維作為支持材料與乙醇脫氫酶共價結(jié)合，底物的轉(zhuǎn)在 2 小時內(nèi)達(dá)到 88%和 99.2%，并且在 8 個循環(huán)后保留了約 4化方法具有所需時間較短、載體與酶分子不易分離等優(yōu)點。然需條件較為劇烈致使酶活損失較高，而且載體可能結(jié)合到酶活。，每種固定方法都存在優(yōu)點和缺點，選擇最合適的固定化技術(shù)的檢測模式。
江南大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章 結(jié)果與討論3.1 膽固醇氧化酶在大腸桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究3.1.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及驗證E. coli. BL21/pET-28a 構(gòu)建 COD 表達(dá)載體 pRhamTM-cod，構(gòu)建流程見圖 3-1。以質(zhì)粒pET28a-cod 作為模板，PCR 擴增膽固醇氧化酶基因 cod，擴增過程引入酶切位點 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ，如圖 3-2(a)，PCR 條帶大小與 cod 基因理論值相符，且條帶單一，PCR 結(jié)果良好。按照 2.2.3 方法得到重組質(zhì)粒 pRhamTM-T-cod，測序正確。重組質(zhì)粒 pRhamTM-cod獲得參考 2.2.4 方法，將獲得的質(zhì)粒采用 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ雙酶切，并通過核酸電泳進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果如圖 3-2(b)所示，可看出其顯示兩條明顯的條帶，目的條帶出現(xiàn)的位置分別與理論值 2575 bp 和 1524 bp 相符，證明重組質(zhì)粒 pRhamTM-cod 構(gòu)建成功。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Cu-MOFs固定化酶制備及染料降解應(yīng)用研究[J]. 高霞,張國春,喬成芳. 商洛學(xué)院學(xué)報. 2018(04)
[2]新型載體PEI修飾樹脂固定化脂肪酶及其在對2-氯丙酸酯拆分中的應(yīng)用[J]. 關(guān)鋒. 橡塑技術(shù)與裝備. 2016(06)
[3]比色法測定膽固醇氧化酶酶活[J]. 季文明,陳毅力,張和春,王武. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報. 2000(03)
[4]用膽固醇氧化酶脫除豬油中的膽固醇[J]. 江正強,沈再春,閻巧娟. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 1996(02)
碩士論文
[1]嗜熱玫瑰紅球菌肌氨酸氧化酶表達(dá)、結(jié)構(gòu)及功能研究[D]. 鄭夢玲.江南大學(xué) 2018
[2]CALB的固定化及其催化合成富含EPA/DHA甘油三酯的研究[D]. 劉向前.華南理工大學(xué) 2017
[3]固定化蛋白酶的制備及其在毛織物防氈縮整理中的應(yīng)用[D]. 鐘業(yè)桂.東華大學(xué) 2010
本文編號：2966986
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