草魚GPATCH3基因的克隆表達(dá)及其在先天免疫中的作用
發(fā)布時(shí)間：2021-01-04 19:30
G-patch結(jié)構(gòu)域廣泛存在于與RNA結(jié)合相關(guān)的蛋白中,該結(jié)構(gòu)域約48個(gè)氨基酸殘基,以富含甘氨酸（Gly）為主要特征。包含G-patch結(jié)構(gòu)域的這些蛋白在不同組織中均有廣泛表達(dá),而且參與到先天免疫、mRNA轉(zhuǎn)錄后加工、發(fā)育和腫瘤增殖等生命活動(dòng)中。其中,GPATCH3是一種在408-456位氨基酸包含此結(jié)構(gòu)域,并在人體各組織廣泛表達(dá)的蛋白。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)人GPATCH3蛋白對RLR信號(hào)通路起著負(fù)調(diào)控的作用。此通路中,RIG-I和MDA5識(shí)別病毒的RNA并激發(fā)下游的一系列信號(hào)傳遞,使IRF3被磷酸化并入核,最終誘導(dǎo)I型干擾素（IFNI）的大量表達(dá)。之后,IFN作為信號(hào)分子可以誘導(dǎo)若干ISGs表達(dá),發(fā)揮抗病毒功能。在對魚類的研究中,與GPATCH3的相關(guān)報(bào)道仍十分稀少,多存在于基因組預(yù)測結(jié)果中。在對斑馬魚的研究中,發(fā)現(xiàn)敲除GPATCH3的個(gè)體在發(fā)育中出現(xiàn)了顱部畸形和眼部畸形。魚類GPATCH3在先天免疫中的功能還沒有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以草魚為材料,借由預(yù)測軟件的輔助,在以脾臟組織為模板建立的cDNA文庫中,成功克隆并獲得了CiGPATCH3的mRNA序列。該基因mRNA全長為1646nt,其中...
【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校
【文章頁數(shù)】：58 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
RLR信號(hào)通路示意圖
圖 2.1 Western blot 電泳裝置組裝示意圖Fig.2.1Assembly diagram of Western blot electrophoresis device2.10.3 洗膜與抗體孵育1)電轉(zhuǎn)完畢，關(guān)掉電源，拆掉裝置，將膜貼著分離膠的一面朝上放入干凈的抗體孵育盒子中，做記號(hào)，正面朝上，右下角用鉛筆點(diǎn)一個(gè)圓點(diǎn)，以免放反。置于脫色搖床上，加入 1×TBS 洗 2 次，每次 5 min。2)用移液管從孵育盒一側(cè)加 10ml 5%封閉液，室溫封閉 1 h。3)用 5%牛奶稀釋一抗。例如 15ml 封閉液加入 5 μl anti-Flag M2(Sigma)，稀釋比例 1:3000。4 ℃過夜孵育。4)第二天早上回收一抗，-20 ℃儲(chǔ)存再用。用 10 ml 1×TBST buffer 洗膜 3次，每次 10 min。5)用 5 %牛奶封閉膜 45 min 后，將牛奶換掉。加入 1:5000 稀釋的二抗，室溫孵育 1 h。注意一抗的來源，選擇合適的二抗，例如 anti-FlagM2(Sigma)是小鼠源的，二抗選擇辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(1 mg/ml，中杉金橋)。
第三章 結(jié)果與分析第三章 結(jié)果與分析H3 mRNA 全長及序列分析脾臟組織為材料構(gòu)建的 cDNA 作為模板，經(jīng)分 mRNA 片段。測序后設(shè)計(jì) 5′RACE 和 3′R模板，擴(kuò)增得到了相應(yīng)片段(圖 3.1)。測序后整 mRNA序列(圖 3.2)。將序列用 DNAMAN7.，3′UTR 共 131nt，編碼序列長 1221nt，蛋白大酸殘基。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重組干擾素上調(diào)草魚干擾素系統(tǒng)基因的表達(dá)[J]. 余新建,李東明,馬梅生,賴啟南,胡成鈺. 水生生物學(xué)報(bào). 2013(06)
[2]草魚腎臟組織細(xì)胞系CIK的建立（簡報(bào)）[J]. 左文功,錢華鑫,許映芳,杜森英,楊先樂. 淡水漁業(yè). 1984(02)
博士論文
[1]草魚NF-κB信號(hào)通路激活及其調(diào)控的分子機(jī)制[D]. 王海舟.南昌大學(xué) 2017
[2]干擾素反應(yīng)調(diào)控因子IRF3的入核機(jī)制研究[D]. 朱明珠.武漢大學(xué) 2015
碩士論文
[1]在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下草魚PERK（EIF2AK3）通過磷酸化eIF2α降低細(xì)胞活性[D]. 張濤.南昌大學(xué) 2018
[2]草魚IRF-2下調(diào)IFN、PKR、PKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制[D]. 谷美慧.南昌大學(xué) 2015
[3]草魚干擾素及其調(diào)節(jié)因子1和7[D]. 馬梅生.南昌大學(xué) 2010
[4]魚類幾種免疫相關(guān)基因的克隆與鑒定[D]. 金紅建.浙江大學(xué) 2002
本文編號(hào)：2957299
【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校
【文章頁數(shù)】：58 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
RLR信號(hào)通路示意圖
圖 2.1 Western blot 電泳裝置組裝示意圖Fig.2.1Assembly diagram of Western blot electrophoresis device2.10.3 洗膜與抗體孵育1)電轉(zhuǎn)完畢，關(guān)掉電源，拆掉裝置，將膜貼著分離膠的一面朝上放入干凈的抗體孵育盒子中，做記號(hào)，正面朝上，右下角用鉛筆點(diǎn)一個(gè)圓點(diǎn)，以免放反。置于脫色搖床上，加入 1×TBS 洗 2 次，每次 5 min。2)用移液管從孵育盒一側(cè)加 10ml 5%封閉液，室溫封閉 1 h。3)用 5%牛奶稀釋一抗。例如 15ml 封閉液加入 5 μl anti-Flag M2(Sigma)，稀釋比例 1:3000。4 ℃過夜孵育。4)第二天早上回收一抗，-20 ℃儲(chǔ)存再用。用 10 ml 1×TBST buffer 洗膜 3次，每次 10 min。5)用 5 %牛奶封閉膜 45 min 后，將牛奶換掉。加入 1:5000 稀釋的二抗，室溫孵育 1 h。注意一抗的來源，選擇合適的二抗，例如 anti-FlagM2(Sigma)是小鼠源的，二抗選擇辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(1 mg/ml，中杉金橋)。
第三章 結(jié)果與分析第三章 結(jié)果與分析H3 mRNA 全長及序列分析脾臟組織為材料構(gòu)建的 cDNA 作為模板，經(jīng)分 mRNA 片段。測序后設(shè)計(jì) 5′RACE 和 3′R模板，擴(kuò)增得到了相應(yīng)片段(圖 3.1)。測序后整 mRNA序列(圖 3.2)。將序列用 DNAMAN7.，3′UTR 共 131nt，編碼序列長 1221nt，蛋白大酸殘基。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重組干擾素上調(diào)草魚干擾素系統(tǒng)基因的表達(dá)[J]. 余新建,李東明,馬梅生,賴啟南,胡成鈺. 水生生物學(xué)報(bào). 2013(06)
[2]草魚腎臟組織細(xì)胞系CIK的建立（簡報(bào)）[J]. 左文功,錢華鑫,許映芳,杜森英,楊先樂. 淡水漁業(yè). 1984(02)
博士論文
[1]草魚NF-κB信號(hào)通路激活及其調(diào)控的分子機(jī)制[D]. 王海舟.南昌大學(xué) 2017
[2]干擾素反應(yīng)調(diào)控因子IRF3的入核機(jī)制研究[D]. 朱明珠.武漢大學(xué) 2015
碩士論文
[1]在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下草魚PERK（EIF2AK3）通過磷酸化eIF2α降低細(xì)胞活性[D]. 張濤.南昌大學(xué) 2018
[2]草魚IRF-2下調(diào)IFN、PKR、PKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制[D]. 谷美慧.南昌大學(xué) 2015
[3]草魚干擾素及其調(diào)節(jié)因子1和7[D]. 馬梅生.南昌大學(xué) 2010
[4]魚類幾種免疫相關(guān)基因的克隆與鑒定[D]. 金紅建.浙江大學(xué) 2002
本文編號(hào)：2957299
本文鏈接：http://sikaile.net/projectlw/swxlw/2957299.html
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