草魚SAMHD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及功能分析
發(fā)布時(shí)間：2020-12-27 21:31
SAMHD1（SAM domain and HD domain containing protein 1）蛋白作為一種宿主限制因子,因其具備獨(dú)特的抗病毒功能而成為分子免疫學(xué)研究熱點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物中,SAMHD1通過水解細(xì)胞內(nèi)的dNTP,耗竭逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制所需的原料從而達(dá)到抗病毒功能。除抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制外,SAMHD1還參與了STING介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路,并且作為宿主限制因子,SAMHD1的缺失將導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫疾病。盡管SAMHD1在哺乳動(dòng)物中已有較多的研究,但是其在魚類當(dāng)中的報(bào)道非常少。本研究探索了草魚SAMHD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及其在先天免疫信號通路中的功能,另外還初步探索了草魚SAMHD1在抑制GCRV病毒的作用。本研究首先通過同源克隆及RACE技術(shù)克隆獲得草魚SAMHD1的全長cDNA（2792 bp）,包括75 bp的5’UTR,833 bp的3’UTR和1884 bp的開放閱讀框（ORF）,開放閱讀框編碼一個(gè)含628個(gè)氨基酸的蛋白。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明草魚SAMHD1與哺乳動(dòng)物SAMHD1一樣具有SAM結(jié)構(gòu)域（核酸結(jié)合位點(diǎn)）和HD結(jié)構(gòu)域,并且與其他魚類SAMHD1的同源性最高。...
【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校
【文章頁數(shù)】：64 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
人的SAMHD1蛋白結(jié)構(gòu)
圖 4.1 魚類 SAMHD1 的氨基酸序列比對Figure 4.1 Amino acid sequences multiple alignments of fish SAMHD112 種魚類 SAMHD1 的氨基酸序列。箭頭指向區(qū)域分別為 SAM 和 HD 結(jié)構(gòu)域。4.2 草魚 SAMHD1 的系統(tǒng)進(jìn)化分析在 NCBI 數(shù)據(jù)中找到 19 個(gè)物種的 SAMHD1 序列信息，將它們的氨基酸序列導(dǎo)出，經(jīng) Clustal X, MEGA 建樹軟件搭建 SAMHD1 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 4.2)。從進(jìn)化樹上分析表明草魚 SAMHD1 與其他魚類 SAMHD1 具有較高的相似性，并且在同一進(jìn)化分支上，其中草魚 SAMHD1 與犀角金線魮(鯉形目鯉科)SAMHD1的進(jìn)化關(guān)系最近。
圖 4.2 SAMHD1 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 4.2 Phlogenetic tree of SAMHD1Clustal X 軟件比對了 19 個(gè)物種中的 SAMHD1 蛋白序列。序列號依次為：彈涂魚(XP_020785555.1) ， 大 黃 魚 (XP_010739883.2) ， 尖 吻 鱸 (XP_018523705.1) ， 青 鳉(XP_004070541.1)，尼羅羅非魚 (XP_003438935.3)，斑馬擬麗魚 (XP_014268301.1)，牙鲆(XP_019952006.1) ， 海 馬 (XP_019746801.1) ， 龍 魚 (XP_018612066.1) ， 點(diǎn) 斑 鸕 鶿(XP_017342242.1)，斑馬魚 (NP_001153405.1)，犀角金線魮 (XP_016374600.1)，小家鼠(NP_001132992.1)，黃牛 (NP_001069329.1)，野豬 (NP_001279034.1)，人(NP_056289.2)，獼猴 (NP_001258571.1)，綠猴 (NP_001279009.1)。圖中實(shí)心三角形標(biāo)注草魚SAMHD1。4.3 草魚 SAMHD1 兔多克隆抗體的特異性為后續(xù)檢測草魚 SAMHD1 的蛋白水平，所以需制備草魚 SAMHD1 的多克隆抗體。將構(gòu)建好的 SAMHD1-antibody-pET32a 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn) BL21 表達(dá)菌中，大量表達(dá)并純化蛋白后免疫日本大耳朵兔制備多克隆抗體，四次免疫后從耳動(dòng)脈取血并制備多抗血清。用預(yù)先抽提得到的 CIK 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行 western blot 驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 75 kD 附近能檢測到一條明顯條帶，并與預(yù)期大小一致，此條帶即為SAMHD1(圖 4.3)。
【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]草魚IRF-2下調(diào)IFN、PKR、PKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制[D]. 谷美慧.南昌大學(xué) 2015
本文編號：2942518
【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校
【文章頁數(shù)】：64 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
人的SAMHD1蛋白結(jié)構(gòu)
圖 4.1 魚類 SAMHD1 的氨基酸序列比對Figure 4.1 Amino acid sequences multiple alignments of fish SAMHD112 種魚類 SAMHD1 的氨基酸序列。箭頭指向區(qū)域分別為 SAM 和 HD 結(jié)構(gòu)域。4.2 草魚 SAMHD1 的系統(tǒng)進(jìn)化分析在 NCBI 數(shù)據(jù)中找到 19 個(gè)物種的 SAMHD1 序列信息，將它們的氨基酸序列導(dǎo)出，經(jīng) Clustal X, MEGA 建樹軟件搭建 SAMHD1 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 4.2)。從進(jìn)化樹上分析表明草魚 SAMHD1 與其他魚類 SAMHD1 具有較高的相似性，并且在同一進(jìn)化分支上，其中草魚 SAMHD1 與犀角金線魮(鯉形目鯉科)SAMHD1的進(jìn)化關(guān)系最近。
圖 4.2 SAMHD1 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 4.2 Phlogenetic tree of SAMHD1Clustal X 軟件比對了 19 個(gè)物種中的 SAMHD1 蛋白序列。序列號依次為：彈涂魚(XP_020785555.1) ， 大 黃 魚 (XP_010739883.2) ， 尖 吻 鱸 (XP_018523705.1) ， 青 鳉(XP_004070541.1)，尼羅羅非魚 (XP_003438935.3)，斑馬擬麗魚 (XP_014268301.1)，牙鲆(XP_019952006.1) ， 海 馬 (XP_019746801.1) ， 龍 魚 (XP_018612066.1) ， 點(diǎn) 斑 鸕 鶿(XP_017342242.1)，斑馬魚 (NP_001153405.1)，犀角金線魮 (XP_016374600.1)，小家鼠(NP_001132992.1)，黃牛 (NP_001069329.1)，野豬 (NP_001279034.1)，人(NP_056289.2)，獼猴 (NP_001258571.1)，綠猴 (NP_001279009.1)。圖中實(shí)心三角形標(biāo)注草魚SAMHD1。4.3 草魚 SAMHD1 兔多克隆抗體的特異性為后續(xù)檢測草魚 SAMHD1 的蛋白水平，所以需制備草魚 SAMHD1 的多克隆抗體。將構(gòu)建好的 SAMHD1-antibody-pET32a 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn) BL21 表達(dá)菌中，大量表達(dá)并純化蛋白后免疫日本大耳朵兔制備多克隆抗體，四次免疫后從耳動(dòng)脈取血并制備多抗血清。用預(yù)先抽提得到的 CIK 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行 western blot 驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 75 kD 附近能檢測到一條明顯條帶，并與預(yù)期大小一致，此條帶即為SAMHD1(圖 4.3)。
【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]草魚IRF-2下調(diào)IFN、PKR、PKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制[D]. 谷美慧.南昌大學(xué) 2015
本文編號：2942518
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