有性生殖是高等真核生物繁衍后代的基本途徑,精子與卵子的融合包括配子結(jié)合與膜融合兩個(gè)過程,是有性生殖的關(guān)鍵步驟。哺乳動(dòng)物精卵融合是一個(gè)多分子參與的過程,但其詳細(xì)的細(xì)胞分子機(jī)制仍不明確。精子上的IZUMO1和卵子上的JUNO及CD9是精卵膜融合過程中已知不可或缺的膜蛋白。其中IZUMO1與JUNO相互識(shí)別介導(dǎo)精卵粘附,然而分別表達(dá)IZUMO1和JUNO的體細(xì)胞能互相結(jié)合但不能融合。CD9的功能未知。因此,精卵融合過程應(yīng)該還存在其他配子蛋白協(xié)助IZUMO1、JUNO和CD9。本實(shí)驗(yàn)通過酵母雙雜交技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)研究了半乳糖苷凝集素家族的兩個(gè)成員LGALS1和LGALS3與IZUMO1、JUNO和CD9的相互作用。首先,克隆了大鼠lgals1和lgals3的cDNA。構(gòu)建了pGAD-lgals1和pGAD-lgals3的酵母表達(dá)載體,分別與實(shí)驗(yàn)室已有的pGBK-Juno、pGBK-Izumo1和pGBK-Cd9進(jìn)行了酵母雙雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LGALS1與JUNO存在相互作用,但與IZUMO1、CD9不存在相互作用;LGALS3與JUNO和IZUMO1均不存在相互作用。構(gòu)建pGEX-lgals... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

Galectin1-4的整體結(jié)構(gòu)示意圖

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文據(jù) UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProtKB-P09382 (LEG1_HUMAN)）注釋：Galectin1 二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成 β 折疊，一處形成 α 螺旋（位于 102-104 個(gè)氨基酸殘基處）。Galectin1 的三級(jí)結(jié) 1.2 B）[33]。每一個(gè) mGal-1 的 N 端和 C 端都處于兩個(gè) mGal-1 結(jié)合面，而 Galectin1 的構(gòu) CRD 則位于遠(yuǎn)端[33]。1993 年發(fā)現(xiàn)人 Galectin1 的 His44、Asn46、Arg48、Glu71和 A保守的親水性殘基（圖 1.2A 中加下劃線氨基酸）[13]，后被證實(shí)是 CRD 的糖結(jié)合活性 的主要組成[41]；另外，一些非帶電氨基酸殘基，如：Glyl4、Phe45、Pro47、Phe49、Va8、Pro78和 Phe79等（圖 1.2A 中加著重號(hào)的氨基酸）也很保守，這些氨基酸殘基可能對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)框架也起到重要作用[13]。圖 1.2 A 中加波浪線的氨基酸為通過范德華力化合物作用的殘基[33]。p13A

Digestion product of pGAD-lgals1 (420 bp) by Nde IBamH I. B: Lane M: Marker (DL-5000)；Lane 1: Digeproduct of pGAD-lgals3 (1783 bp) by Nde I and BamH I..2 轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母后的菌落 PCR 鑒定LiAc 法制備 Y2H、Y187 感受態(tài)酵母。分別將 pGAD-lgals1 轉(zhuǎn)入感受態(tài) Y187；pGBK-JunBK-Izumo1 轉(zhuǎn)入感受態(tài) Y2H。分別挑取 SD/-Leu 和 SD/-Trp 平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落（）溶于 20 μL 0.9%的生理鹽水中混勻，沸水煮 5 min，-20℃冰凍 30 min，重復(fù) 2 次。后取 1 μL 作為模板進(jìn)行 PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖 2.10。泳化 pGBK-Izumo1 質(zhì)粒的酵母（Y2H）菌落 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果，特異性條帶位于 100，與Izumo1的預(yù)期產(chǎn)物（1089 bp）大小相符。泳道2為轉(zhuǎn)化pGAD-lgals1質(zhì)粒的酵母（Y1 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果，特異性條帶位于 500 bp 微下，與 lgals1 預(yù)期產(chǎn)物（420） bp 大。圖中泳道 3 為轉(zhuǎn)化 pGBK-Juno 質(zhì)粒的酵母（Y2H）菌落 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果，位于 500的中間有特異性條帶，與預(yù)期 Juno PCR 產(chǎn)物（609 bp）大小相符。圖 2.10 結(jié)果證明AD-lgals1、pGBK-Juno、pGBK-Izumo1 成功轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞，可用于下一步實(shí)驗(yàn)250100500bp M A1 A2 A3 B1 M bp bp M C1 C2 C3


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