畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一,組成型啟動(dòng)子P_GAP和甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_AOX1均能實(shí)現(xiàn)大多數(shù)外源蛋白的高效表達(dá)。然而,這兩個(gè)啟動(dòng)子在調(diào)控重組蛋白表達(dá)時(shí)存在明顯缺陷,如應(yīng)用P_GAP時(shí)發(fā)酵過程不能精準(zhǔn)調(diào)節(jié),無法適用于毒性蛋白的表達(dá);應(yīng)用P_AOX1時(shí)需要以有毒易燃的甲醇為誘導(dǎo)劑,不適于醫(yī)藥食品相關(guān)重組蛋白的表達(dá)。因而,亟待開發(fā)新型啟動(dòng)子應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室前期研究了Pichia pastoris鼠李糖代謝途徑相關(guān)基因LRA1-LRA4及調(diào)控基因rhaR,發(fā)現(xiàn)LRA3基因的啟動(dòng)子P_LRA3可實(shí)現(xiàn)重組蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá),有望將其應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)的工業(yè)生產(chǎn)中,但對(duì)P_LRA尚未進(jìn)行深入研究。本文首先通過基因敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了rhaR參與畢赤酵母鼠李糖代謝;EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rhaR編碼的蛋白R(shí)haR可結(jié)合于P_LRA3,并揭示了其結(jié)合位點(diǎn);通過CRRT-PCR方法揭示了P_LRA3的轉(zhuǎn)... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 rhaR 參與畢赤酵母鼠李糖代94℃ 30 s28 cycles 58℃ 30 s72℃ 2 min72℃ 10 min25℃ 2 min擴(kuò)增結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。2.5 調(diào)控基因 rhaR 無痕敲除菌株的構(gòu)建rhaR 基因無痕敲除菌株構(gòu)建過程見圖 2.2。外源 DNA 片段導(dǎo)入畢赤酵母后，基因組同源 DN段-AB 片段和 C 片段，與基因 rhaR 兩側(cè)片段進(jìn)行雙交換，將 rhaR 基因雙交換下來，同時(shí) A C 之間序列插入基因組中；第二次重組發(fā)生在基因組內(nèi)，mazF 表達(dá)盒和 zeocin 表達(dá)盒兩側(cè)同 B 序列互補(bǔ)發(fā)生重組，將 mazF 表達(dá)盒、zeocin 表達(dá)盒和其中一個(gè) B 片段刪除，完成 rh因的無痕敲除。

72℃ 1025℃ 2 泳檢測(cè)�；� rhaR 敲除及回補(bǔ)菌株 及 GS115/rhaRC 劃線于 MDH、基上生長(zhǎng)差異情況。伸 PCR 連接，分別以 A-F（Swa1）/B-xR NA 片段：AB 和 C 片段，片段

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：2929053