精原干細胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是哺乳動物體內唯一可以將遺傳信息傳遞給下一代、功能單一的干細胞,體外分離培養(yǎng)SSCs為探索其生物學特性及其增殖、分化與去分化機制奠定了基礎。SSCs在特定的體外培養(yǎng)條件下,即使無外源基因操作也可以重編程形成多能干細胞。多能干細胞不僅具有自我復制的能力,而且具有形成多種組織和細胞的能力,具有很大的潛在應用前景。誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）雖然在體內外可分化形成三胚層,但由于外源基因的插入使其應用受到制約。因此,SSCs更適用于人類臨床及動物分子育種應用。本研究分為兩部分,第一部分實驗以小鼠作為動物模型,分離、純化并體外培養(yǎng)小鼠精原干細胞（mouse spermatogonial stem cells,m SSCs）。采用機械分離法、兩步酶消化法結合連續(xù)差速貼壁法成功分離、純化得到來源于Oct4/GFP×CD1雜交品系F1代小鼠睪丸的mSSCs,并對體外培養(yǎng)的mSSCs進行鑒定分析。當細胞穩(wěn)定生長時,通過觀察細胞形態(tài)、堿性磷酸酶染色、免疫熒光染色、RT-... 

【文章來源】：內蒙古大學內蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數】：59 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

飼養(yǎng)層細胞形態(tài)

圖 2.2 差速貼壁法富集的 mSSCs 形態(tài)A：培養(yǎng) 45 min 后貼壁的細胞 B：培養(yǎng) 1 h 后懸浮的細胞C：培養(yǎng) 2 h 后懸浮的細胞 D：過夜培養(yǎng)后的細胞Figure 2.2 The morphology of mouse Spermatogonial Stem Cells enriched by differential adhesion methoA: cells adhered for 45 minutes. B:not adhered cells cultured for 1 hour.C: Suspended cells cultured for 2 hours. D: Cells cultured overnight.3.3 mSSCs 的形態(tài)將經過過夜貼壁富集的細胞接種到飼養(yǎng)層細胞上進行培養(yǎng)，2 d 后開始增殖，4 d 后度顯著提高，7 d 左右可見到經典的葡萄狀克隆。以后每 7 d 進行一次傳代，在體外傳時細胞形態(tài)沒有發(fā)生變化。由于本實驗使用的小鼠睪丸來源于 GFP 轉基因小鼠，因此

圖 2.3 mSSCs 形態(tài)A：小鼠 SSCs 在飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng) 7 d 的形態(tài) B：小鼠 SSCs 體外培養(yǎng)第 6 代的形態(tài)C、D：體外培養(yǎng)小鼠 SSCs 的綠色熒光表達情況Figure 2.3 The morphology of mouse spermatogonial stem cells.: Morphology of mouse SSCs cultured on feeder cells for 7 days. B: Morphology of the sixth generatiomouse SSCs cultured in vitro. C、D:.GFP expression of mouse SSCs in vitro.4 mSSCs 堿性磷酸酶表達的檢測結果在早期胚胎中，AP 活性較高，隨著胚胎細胞的分化，其表達 AP 的水平逐漸降低，末端，細胞失去 AP 的活性。通常，干細胞中都會表達一定的 AP 活性。AP 在多能活性最強。因此，可以通過檢測細胞是否表達 AP 陽性來確定其是否具有干性。如


本文編號：2902844