目的:本科室前期通過質譜檢測發(fā)現(xiàn),DOC-1R(Deleted In Oral Cancer-1 Related)可能與酪蛋白激酶2(Casein Kinase 2,CK2)的α亞基及過氧化物酶1(peroxiredoxin 1,PRDX1)具有相互作用,本研究通過Pull-Down、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-Ip)等方法證實DOC-1R與CK2α及PRDX1的相互作用,并通過構建DOC-1R截短蛋白載體及Pull-Down分別初步探究DOC-1R與CK2α及PRDX1蛋白的結合區(qū)域,為進一步研究DOC-1R的生物學功能及其作用機制奠定基礎。研究方法:1 GST Pull-Down分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1的結合將轉化有pGEX-5X-1及重組載體pGEX-DOC-1R的E.coli BL21菌株進行誘導表達,所得到的菌體裂解后收集GST蛋白及GST-DOC-1R融合蛋白,與MagneGST particle混勻孵育,加入HEK-293細胞總蛋白進行GST Pull-Down實驗,Western Blot分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1蛋白的結合情況。2 Co-Ip分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1的相互作用常規(guī)培養(yǎng)DOC-1R及對照病毒感染的HeLa細胞,裂解細胞獲得總蛋白,分為兩個實驗組:分別用FLAG抗體、CK2α抗體或PRDX1抗體進行免疫共沉淀反應,通過Western Blot方法分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1蛋白的相互作用。3構建缺失型DOC-1R原核表達載體,誘導表達重組蛋白并通過GST Pull-Down分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1的結合區(qū)域以本室前期構建的pGEX-DOC-1R質粒為模板,分別構建pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63三種缺失型DOC-1R原核表達載體。經菌落PCR鑒定,擴大培養(yǎng)陽性克隆菌落,提取質粒進行酶切鑒定后對三種缺失型pGEX-DOC-1R重組表達載體進行DNA測序分析。將編碼序列正確、開放閱讀框架完整的三種缺失型pGEX-DOC-1R重組表達載體轉化E.coli BL21感受態(tài)細胞中,誘導表達并收集菌液。將菌液進行SDS-PAGE凝膠電泳,考馬斯亮藍染色并脫色以檢測融合蛋白的表達情況。將新構建的三種含有缺失型DOC-1R的大腸桿菌(pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63)、本科室前期構建及保存的含有缺失型DOC-1R的大腸桿菌(pGEX-DOC-1RdelC63、pGEX-DOC-1RdelC30、pGEX-DOC-1RdelC20、pGEX-DOC-1RdelC7)及對照菌分別誘導表達,并將得到的菌液裂解,收集融合蛋白,與MagneGST particle混勻孵育,4 h后加入HEK-293細胞總蛋白混勻孵育過夜,Western Blot分別檢測缺失型DOC-1R蛋白與CK2α及PRDX1的結合。結果:1 GST Pull-Down實驗證明DOC-1R分別結合CK2α及PRDX1蛋白通過Pull-down及Western Blot實驗,證實DOC-1R分別與CK2α及PRDX1蛋白結合,同時我們在洗脫物中應用CK2β抗體檢測到了CK2β的存在。2 Co-Ip實驗證明DOC-1R分別與CK2α及PRDX1相互作用通過Co-Ip和Western Blot實驗,檢測可知DOC-1R分別與CK2α及PRDX1蛋白存在相互作用。3構建缺失型DOC-1R原核表達載體并誘導表達重組蛋白以分別初步確定DOC-1R與CK2α及PRDX1蛋白結合的關鍵區(qū)域截短的DOC-1R片段已經成功插入pGEX-5X-1載體中,目的片段序列正確且開放閱讀框架完整,截短的DOC-1RdelN42、DOC-1RdelC42、DOC-1RdelN63在37℃誘導3 h時均大量表達。DOC-1R第107-119位氨基酸區(qū)域結合CK2α蛋白,且DOC-1R第85-126位氨基酸區(qū)域結合PRDX1蛋白。結論:1.應用GST Pull-Down和Co-Ip技術證實DOC-1R分別與CK2α及PRDX1相互結合。2.應用重組技術及GST Pull-Down技術證明,DOC-1R與CK2α結合區(qū)域在DOC-1R的第107-119位氨基酸區(qū)域,DOC-1R與PRDX1蛋白的結合區(qū)域在DOC-1R的第85-126位氨基酸區(qū)域。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文取生長狀態(tài)良好的感染了 Lv-DOC-1R 及對照病毒的人宮頸癌細胞系 HBS 清洗 3 次，加入 500 μl RIPA 細胞裂解液，冰上裂解細胞，將細胞收集內，4℃條件下 12,000 rpm 離心 15 min，吸取上清備用。分為兩個實驗組，分別用 Protein G PLUS-Agarose 和 Anti-Flag Affinity Gel 進行 Ip 實驗，用相應抗體進行 Western Blot 檢測，從而確定 DOC-1R 分別與 CK2α及 P互作用。0 缺失型 DOC-1R 引物的設計與合成利用人 DOC-1R 基因的 cDNA 序列進行引物的設計，5’端引物引入 Bam點，3’端引物包含終止密碼子并引入 XhoⅠ酶切位點，設計了三對缺-1R 引物，分別缺失 DOC-1R 的第 1-42、85-126、1-63 位氨基酸編碼基因 1）。

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3 實驗結果Pull-Down 結合 Western Blot 分別證實 DOC-1R 與白在體外存在結合譜實驗檢測結果提示 CK2α、PRDX1 可能分別結合 DOC-1RPull-Down 法分別檢測二者與 DOC-1R 的結合，用 CK2α抗抗進行 Western-Blot 鑒定，結果顯示在體外，CK2α及 PRDOC-1R 結合（圖 2，圖 3）。同時我們在洗脫物中應用 CK2存在（圖 2）。

圖 3 在體外 DOC-1R 結合 PRDX1 蛋白結合Western Blot分別證實DOC-1R與CK2α及PRD在相互作用狀態(tài)良好的感染了Lv-DOC-1R及對照病毒的人宮頸癌細胞，分為兩個實驗組，分別用 Protein G PLUS-Agarose 及ffinity Gel 進行 Ip 實驗，在本實驗條件下實驗組中 CK2αC-1R 目的條帶均能被檢測到，而對照組未檢測出目的蛋白， 分別與 CK2α及 PRDX1 具有相互作用（圖 4，圖 5）。
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本文編號：2886733