所有的好氧生物都需要面臨“如何維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)”這一問(wèn)題。氧自由基(reactive oxygen species,ROS)包括過(guò)氧化氫、超氧陰離子自由基、羥基自由基和單線(xiàn)態(tài)氧,是造成細(xì)胞內(nèi)氧化壓力過(guò)大的重要原因之一,會(huì)導(dǎo)致生物大分子(蛋白質(zhì)、DNA和脂類(lèi))受損,進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞內(nèi)的ROS水平既受細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝影響,又受細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的影響。目前已知的能夠清除ROS的蛋白酶包括過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物還原酶(Peroxiredoxins、Prxs)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione Peroxidase,Gpxs)和一些依賴(lài)金屬離子進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的酶,而Prxs因?yàn)槠浯呋行慕Y(jié)構(gòu)的特殊性,對(duì)過(guò)氧化物更敏感,反應(yīng)更迅速,因此在維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用。相比于其他的能夠清除ROS的蛋白酶,人們對(duì)于Prxs的研究起步較晚,并且研究對(duì)象主要集中在真核生物,尤其是哺乳動(dòng)物領(lǐng)域,對(duì)于古菌中的Prxs研究較少。而冰島硫化葉菌REY15A作為一種嗜熱嗜酸的泉古菌,其細(xì)胞內(nèi)的Prxs是否具有特殊的性質(zhì)和功能尚未可知。因此本課題開(kāi)展了冰島硫化葉菌REY15A中的Prxs性質(zhì)鑒定和功能分析。首先,我們通過(guò)生物信息學(xué)分析,找到了冰島硫化葉菌REY15A中7種被注釋(預(yù)測(cè))的Prxs,分別是SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725、SiRe_0977、SiRe_1643、SiRe_2162、SiRe_2592,其中 SiRe_1643和 SiRe_2162是類(lèi)Prxs家族,本課題沒(méi)有開(kāi)展進(jìn)一步研究。我們分析了其余5種Prxs在古菌中的保守性,預(yù)測(cè)它們的活性位點(diǎn)。通過(guò)序列比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)SiRe_0067、SiRe 0346、SiRe_0725和SiRe_2592在古菌中的保守性較強(qiáng),并且它們的催化位點(diǎn)滿(mǎn)足PXXXT/SXXCp(Cp是催化活性位點(diǎn)的半胱氨酸)的序列。然后,構(gòu)建了在大腸桿菌與硫化葉菌中蛋白表達(dá)的質(zhì)粒,表達(dá)純化了野生型和活性缺失突變Prxs。接下來(lái),我們對(duì)這些Prxs的體外性質(zhì)進(jìn)行了鑒定,以過(guò)氧化氫和叔丁基過(guò)氧化氫為底物,鑒定了這5種Prxs蛋白是否具有過(guò)氧化物酶活性并比較還原能力強(qiáng)弱的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SiRe_0346、SiRe_0067與SiRe 2592能夠與過(guò)氧化氫和叔丁基過(guò)氧化氫發(fā)生氧化還原反應(yīng),具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性,而且C42是SiRe_0067的催化活性位點(diǎn),C45/50是SiRe_2592的催化活性位點(diǎn)。以單鏈DNA、雙鏈環(huán)狀DNA、雙鏈線(xiàn)性DNA為底物,鑒定這些蛋白是否具有與DNA相結(jié)合的能力以及影響其與DNA結(jié)合的因素分析,我們發(fā)現(xiàn)SiRe_0067和SiRe_0067-C42S(活性缺失突變體)能與DNA結(jié)合,SiRe_0067的氧化還原狀態(tài)能夠影響其DNA結(jié)合能力,被過(guò)氧化氫氧化后的SiRe_0067不能與DNA結(jié)合。鑒定了這些Prxs是否能夠保護(hù)DNA免受羥基自由基(ROS中毒性最強(qiáng)的活性氧自由基)的損傷,我們發(fā)現(xiàn)SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725和SiRe_2592能夠在一定程度上保護(hù)DNA免受羥基自由基的攻擊,其中SiRe_0346的保護(hù)能力最強(qiáng)。接著,我們通過(guò)體內(nèi)過(guò)表達(dá)這5種Prxs,分析蛋白過(guò)表達(dá)是否會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成影響,我們發(fā)現(xiàn)只有SiRe_0067過(guò)表達(dá)會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)變慢,其余Prxs過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響。鑒定當(dāng)細(xì)胞遭受氧化壓力時(shí),Prxs蛋白的過(guò)表達(dá)能否保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,我們發(fā)現(xiàn)SiRe_0346展現(xiàn)出了較強(qiáng)的保護(hù)細(xì)胞免于氧化壓力的作用。最后,對(duì)基因組上編碼的Prxs的C末端原位添加6×組氨酸標(biāo)簽,通過(guò)Western-Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析Prxs在正常狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)的含量差異以及當(dāng)細(xì)胞遭受氧化壓力時(shí),Prxs的表達(dá)水平的變化。在體外性質(zhì)鑒定的實(shí)驗(yàn)中,SiRe_0346展現(xiàn)出了能夠高效地還原過(guò)氧化氫、叔丁基過(guò)氧化氫和羥基自由基的反應(yīng)活性;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,SiRe_0346能夠在一定程度上提高細(xì)胞抵抗氧化壓力的能力,由此,我們認(rèn)為SiRe_0346在冰島硫化葉菌REY15A中是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要Prxs,而這一結(jié)果也與Sulfolobus bolfatarocus P2被UV處理后,SS02121(SiRe_0346的同源蛋白)的轉(zhuǎn)錄水平翻倍相符合。在體外實(shí)驗(yàn)中,SiRe_0067與SiRe_2592也展現(xiàn)出了一定的清除過(guò)氧化物和自由基的能力,因此它們很可能在冰島硫化葉菌REY15A中作為備份蛋白存在,當(dāng)SiRe_0346不能發(fā)揮作用時(shí)能夠保持細(xì)胞免受氧化壓力的損傷�？紤]到SiRe_0067的獨(dú)特性質(zhì),作為Prxs中唯一一個(gè)具有DNA結(jié)合能力,并且唯一一個(gè)過(guò)表達(dá)后能夠影響細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白,我們推測(cè)SiRe_0067可能參與到細(xì)胞內(nèi)的氧化信號(hào)傳導(dǎo)途徑,而SiRe_0067的氧化還原狀態(tài)能夠參與調(diào)節(jié)其功能。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q936;Q933
【部分圖文】：

據(jù)ＣＲ存在與否與反應(yīng)機(jī)理的差異對(duì)Ｐｒｘｓ的分類(lèi)。ＰｒｘｓＣｙｓ?（ａ），非典型的?２－Ｃｙｓ?（ｂ）與?１－Ｃｙｓ?Ｃｃ）??１?Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐｒｅｓ?ａｃｃｏｒｄｉｎｇ?ｔｏ?ｗｈｅｔｈｅｒ?Ｃｒ?ｅｘｉｓｔｓ?ｏｒ?ｎｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．?Ｐｒｘｓ?ｉｎｃｌｕｄｅ?２－Ｃｙｓ?（ａ）．?ａｔｙｐｉｃａｌ?２－ＣｙＣｙｓ?（ｃ）??，根據(jù)過(guò)氧化氫在細(xì)胞內(nèi)的含量以及扮演的角色，Ｐｒｅ。首先，當(dāng)過(guò)氧化氫含量過(guò)高，能夠?qū)?xì)胞造成損傷還原，降低其毒害作用，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)６Ｑ。其次，當(dāng)中作為信號(hào)分子或是第二信使，進(jìn)而引發(fā)下游反應(yīng)時(shí)，信號(hào)的傳遞者“，因?yàn)椋校颍笈c過(guò)氧化氫有著較高的親應(yīng)速度與敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于“下游蛋白”，被氧化的Ｐｒｘｓ是一種更為有效的“氧化信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制？。而且，據(jù)６２

００６７－Ｃ４２Ｓ－ｎｏ－ｈｉｓ，以及冰島硫化葉菌??表達(dá)質(zhì)粒?ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ＿２５９２－ｎｏ－ｌｉｉｓ、ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ—２５９２－Ｃ－ｈｉｓ、ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ—２５９２－??Ｃ４５／５０Ｓ－Ｃ－ｈｉｓ，圖３．１顯示構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切驗(yàn)證的結(jié)果，并且以下所有質(zhì)??粒都測(cè)序驗(yàn)證正確。其中基因片斷的長(zhǎng)度如下：５０＾＿００６７為４５０匕卩，??ＳｉＲｅ＿０３４６Ｓ?６４８?ｂｐ，ＳｉＲｅ＿０７２５?Ｓ４６２?ｂｐ，ＳｉＲｅ＿０９７７Ｓ?４３２?ｂｐ，?ＳｉＲｅ＿２５９２??為?４７１?ｂｐ。??我們所選用的大腸桿菌表達(dá)載體ｐＥＴ２２ｂ?（質(zhì)粒示意圖參見(jiàn)附錄八），全長(zhǎng)??５４９３?ｂｐ，插入目的基因的位置在多克隆位點(diǎn)的ＴＷｆｅｌ?（２８８）與＆／／Ｉ?（１７９）??之間。冰島硫化葉菌的表達(dá)質(zhì)粒ｐＳｅＳＤ?（參見(jiàn)附錄八），全長(zhǎng)８４３４?ｂｐ，目的基??因插入在ＡＷｅｌ?（７７）與＆／Ｉ?（１８４）之間。??ｌｌｉｌｉｉ?ｉｆ??圖３．１表達(dá)質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證結(jié)果??Ｆｉｇ．?３．１?Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｂｙ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ??ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??圖３．１表示當(dāng)質(zhì)粒構(gòu)建完成后用ＡＷｅ?Ｉ與■＆／１進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證的結(jié)果

（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ?２００）分離純化之后得到純的ＳｉＲｅ＿００６７－ｎｏ－ｌｉｉｓ蛋白。圖３．２Ａ表示??分子篩分離得到圖譜，圖３．２Ｂ是對(duì)圖３．２Ａ中的第８－１３管ＳＤＳ－ＰＡＧＥ驗(yàn)證結(jié)果，??其中Ｃ表示樣品經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換柱分離，濃縮之后得到的蛋白。濃縮９－１３管，??液氮凍存，－８０°Ｃ保存。??３．３．２．２從大腸桿菌中純化ＳｉＲｃ＿００６７－Ｃ４２Ｓ??同ＳｉＲｅＪＫ＾Ｔ－ｎｏ－ｈｉｓ的純化過(guò)程類(lèi)似，熱處理之后的上清樣品經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子??交換柱和分子篩分離純化之后得到純的活性缺失突變體蛋白ＳｉＲｅ＿００６７－Ｃ４２Ｓ。??２２??
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1 鐘晴;冰島硫化葉菌REY15A中過(guò)氧化物還原酶的性質(zhì)鑒定和初步遺傳分析[D];山東大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2882112