臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。UCMSCs具有來源豐富、不涉及倫理道德、低免疫原性、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)及能分化為多種體細(xì)胞等特征,因此,UCMSCs的相關(guān)研究備受關(guān)注。目前,已成功從人、大鼠、兔、豬等動物分離獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,但與其相比,關(guān)于綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,sUCMSCs)的分離、培養(yǎng)及定向分化等研究的相關(guān)報道甚少。綿羊是基礎(chǔ)生物學(xué)及畜牧學(xué)等研究領(lǐng)域的重要大動物模型。據(jù)此,本研究在改良sUCMSCs分離及培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上,探討了誘導(dǎo)sUCMSCs為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)的同時將sUCMSCs定向誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞并初步探究其在體內(nèi)修復(fù)損傷組織的作用機(jī)制。本研究主要研究結(jié)果如下:1.建立了組織塊二次貼壁分離綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,并用改良的無血清體系在體外擴(kuò)增培養(yǎng)獲得了綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)鑒定,所獲得的sUCMSCs的免疫表型在高表達(dá)CD90、CD105及CD44(表達(dá)量在95%以上)的同時,低表達(dá)CD45、CD34及CD14(表達(dá)量在2%以下)。此外,組織塊二次貼壁法獲得的sUCMSCs可在體外傳至12代,并且能向成骨、成脂及成軟骨細(xì)胞方向分化。2.采用Yamanaka的OSKM四因子方法誘導(dǎo)sUCMSCs為iPSCs,獲得了類胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)的克隆樣細(xì)胞,對其進(jìn)行堿性磷酸酶染色鑒定,結(jié)果顯示克隆呈棕紅色的陽性結(jié)果;此外,對所獲得的克隆進(jìn)行多能性因子表達(dá)情況的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),克隆表達(dá)多能性因子OCT-4、SSEA-4、Nanog及TRA-1-81;為檢測獲得的sUCMSCs來源的克隆在體內(nèi)分化能力,將克隆制備成單細(xì)胞懸液后注射免疫缺陷小鼠腋下,在注射后第4周采集畸胎瘤制成石蠟切片后進(jìn)行HE染色,在倒置顯微鏡下可觀察到肌肉、毛囊、腺體等三個胚層的組織。3.采用5-氮雜胞苷聯(lián)合馬血清法,誘導(dǎo)sUCMSCs分化為成肌細(xì)胞,檢測分化不同時期成肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白Desmin、MyHC及MyoD與標(biāo)志分子Desmin、Myf5及MyoG的表達(dá)情況;此外,將sUCMSCs、分化第14天的成肌細(xì)胞及絲裂霉素C處理的sUCMSCs移植入肌肉損傷模型小鼠的脛骨前肌,在移植細(xì)胞后不同時間經(jīng)石蠟切片并HE染色,檢測小鼠損傷的肌肉的修復(fù)情況。結(jié)果顯示:(1)在5-氮雜胞苷及馬血清的聯(lián)合作用下,sUCMSCs在誘導(dǎo)分化第3天Myf5基因開始表達(dá);第7天個別細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,呈桿狀、多角狀,細(xì)胞增殖減緩,且成肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白Desmin、MyHC及MyoD均有表達(dá),有部分細(xì)胞發(fā)生融合;在分化第14天Desmin及MyoG基因表達(dá)量升高,細(xì)胞增殖持續(xù)減緩,融合細(xì)胞增多,且融合后的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核增多;在分化的第21天Desmin基因表達(dá)量驟升,且細(xì)胞代謝產(chǎn)物增多,出現(xiàn)肌管樣結(jié)構(gòu);(2)在細(xì)胞移植后,sUCMSCs組小鼠損傷肌肉后第2天即進(jìn)入修復(fù)期,在第10天肌纖維排列致密,彼此融合,損傷肌肉基本恢復(fù)正常;成肌細(xì)胞組小鼠損傷肌肉第3天即進(jìn)入修復(fù)期,在第14天肌纖維排列致密,彼此融合,損傷肌肉基本恢復(fù)正常;絲裂霉素C組及對照組小鼠損傷肌肉在第2-3天進(jìn)入修復(fù)期,且在第10天損傷肌肉未能完全修復(fù),肌纖維之間仍存在明顯的空隙,第14天肌肉也未能完全恢復(fù)正常。綜上所述,采用二次貼壁法及無血清培養(yǎng)體系可獲得形態(tài)及體外增殖能力正常、且表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志分子并具有多向分化潛能的sUCMSCs。所獲得的sUCMSCs不僅能誘導(dǎo)為iPSCs,而且可分化為對小鼠損傷肌肉有修復(fù)功能的成肌細(xì)胞。本研究為建立完善的綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)及探明間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化及修復(fù)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q2-33
【部分圖文】：

?傳統(tǒng)組織塊貼壁法，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含ＦＢＳ）培養(yǎng)４８ｈ即貼壁４天可見呈長梭形的??細(xì)胞爬出（圖２．１ａ），９天左右細(xì)胞融合度可達(dá)９０％?（圖２．１ｂ）；使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的組??織塊同樣４８ｈ貼壁４天可見呈長梭形的細(xì)胞爬出（圖２．１ｃ），１０天左右細(xì)胞融合度可達(dá)９０％??（圖?２．１ｄ）。??二次貼壁法，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含ＦＢＳ）培養(yǎng)２４ｈ即可見組織塊貼壁，２天細(xì)胞即爬出??（圖２．１ｅ），６天左右細(xì)胞融合度可達(dá)９０％?（圖２．１ｆ）；使用無血清培養(yǎng)基２４ｈ可見組織塊貼??壁，２天可見細(xì)胞爬出（圖２．?ｌｇ），?６天左右細(xì)胞融合度可達(dá)９０％?（圖２．?ｌｈ）。??４組細(xì)胞在貼壁伸展后均呈長梭形，待細(xì)胞融合度達(dá)８５％時，排列緊密，呈渦旋狀或指??紋狀，上述結(jié)果表明與傳統(tǒng)組織塊貼壁法相比，二次貼壁法的組織塊貼壁更快，細(xì)胞爬出時??間更短，且能將有限的材料在短時間內(nèi)充分利用并獲取數(shù)量加倍的細(xì)胞。此外，通過比較含??血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基分離原代細(xì)胞的結(jié)果發(fā)現(xiàn)

養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞使用Ｔｉｙｐｓｉｎ，而無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞使用ＴｒｙｐＬＥ）將４組綿羊臍帶間??充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行消化傳代擴(kuò)增。??４組綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的Ｐ３代細(xì)胞增殖速度一致，３ｄ融合度均可達(dá)８５％?（圖２．２??ａ，ｃ，ｅ，ｇ），且細(xì)胞排列緊密，呈指紋狀，細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生??長，細(xì)胞飽滿，細(xì)胞核大，胞衆(zhòng)透明無雜質(zhì)，而Ｐ１２代細(xì)胞在３＞４ｄ內(nèi)融合度也可達(dá)８５％，??細(xì)胞形態(tài)正常，與Ｐ３代細(xì)胞相似，呈長梭形旋禍狀貼壁生長（圖２．２?ｂ，ｄ，ｆ，ｈ）。上述結(jié)??果表明，二次貼壁法獲得的細(xì)胞與傳統(tǒng)的貼壁法獲得的細(xì)胞在傳代培養(yǎng)后細(xì)胞生長速度一??致，細(xì)胞形態(tài)及狀態(tài)無明顯差異，無血清培養(yǎng)基并未因缺乏ＦＢＳ而對細(xì)胞造成不良影響，??傳代后的細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)與含ＦＢＳ培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞無明顯差異

?臺期，分別比較４組細(xì)胞Ｐ３及Ｐ１２代細(xì)胞的增殖能力發(fā)現(xiàn)，（１）傳統(tǒng)貼壁法，間充質(zhì)干細(xì)??胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基獲得的Ｐ３代細(xì)胞的増殖能力均強(qiáng)于Ｐ１２代細(xì)胞（圖２．３?ｂ，??ｄ）；?（２）二次貼壁法，間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基獲得的獲得Ｐ３代細(xì)胞的增??殖能力均較Ｐ１２代細(xì)胞強(qiáng)（圖２．３?ｃ，?ｅ）。上述結(jié)果說明，組織塊二次貼壁法獲得的綿羊臍??帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力與傳統(tǒng)組織塊貼壁法獲得的細(xì)胞無顯著差異，此外，無血清培養(yǎng)??體系培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖能力與含ＦＢＳ的培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞也無明顯差異，但是Ｐ１２代細(xì)胞??的增殖能力比Ｐ３代細(xì)胞略低。??ａ?ｂｅ??２．〇ｉ??？１５＿?＾?ｊ??匕?１．０－??????
【參考文獻(xiàn)】

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1 邵偉;秦小惠;古再麗;況玲;余雄;;綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化[J];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2012年04期

2 張勇;鄒仲敏;郭朝華;周進(jìn)明;王勁;羅成基;程天民;;間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)MyoD轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)為成肌細(xì)胞后對肌損傷的修復(fù)作用[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2008年11期

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1 宋紅衛(wèi);利用綿羊多能性因子誘導(dǎo)小鼠體細(xì)胞為多能性干細(xì)胞[D];東北林業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2877840