白樺(Betula platyphylla Suk.)是中國(guó)北方重要的林木樹(shù)種之一,單性花,雌雄同株,具有重要的研究?jī)r(jià)值。SPL(SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的基因家族,廣泛存在于綠色植物中,它在調(diào)控葉片發(fā)育、花和果實(shí)發(fā)育、育性等方面起重要作用。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的信息,從白樺中克隆到BpSPL3、BpSPL9和BpSPL10基因的ORF序列,并構(gòu)建相應(yīng)過(guò)表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體,分別命名為:35::BpSPL3-GFP、35S::BpSPL9-GFP、35S::BpSPL10-GFP、35S::BpSPL3-RNAi、35S::BpSPL9-RNAi 和 35S::BpSPL10-RNAi。同時(shí)通過(guò)雙酶切的方法克隆出起始密碼子上游2000bp的啟動(dòng)子序列并構(gòu)建帶有GUS標(biāo)簽的表達(dá)載體,依次命名為 BpSPL3::GUS,BpSPL9::GUS,BpSPL10::GUS。對(duì)BpSPL3、BpSPL9和BpSPL10基因的啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)上述基因的啟動(dòng)子序列除含有核心啟動(dòng)子元件外,還含有光響應(yīng)作用元件,激素類(lèi)相應(yīng)元件,非生物脅迫類(lèi)響應(yīng)元件等。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將BpSPL3::GUS表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至白樺以及蘸花法穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化至擬南芥中,結(jié)果顯示BpSPL3啟動(dòng)子在白樺中的葉片毛狀體、莖、芽和根上有高度表達(dá);在擬南芥中的新葉毛狀體、老葉的葉邊緣處、側(cè)根和雌蕊柱頭中有較高的GUS表達(dá)活性。通過(guò)亞細(xì)胞定位的方法發(fā)現(xiàn)BpSPL3基因特異性定位于細(xì)胞核中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法遺傳轉(zhuǎn)化獲得BpSPL3基因的轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)對(duì)的轉(zhuǎn)基因株系分析發(fā)現(xiàn)BpSPL3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株根長(zhǎng)變短,蓮座葉數(shù)量顯著減少,初級(jí)莖數(shù)量增加,角果長(zhǎng)度及數(shù)量減少,同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)BpSPL3轉(zhuǎn)基因株系四輪花器官均顯著減小。實(shí)時(shí)熒光定量分析PNY、LFY、LBD10和LBD27基因在轉(zhuǎn)基因植株花序中的表達(dá)量水平,結(jié)果顯示表達(dá)量均提高2-4倍不等。表明在過(guò)表達(dá)BpSPL3轉(zhuǎn)基因擬南芥中,PNY、LFY、LBD10和LBD27基因可能直接或間接參與花發(fā)育,并受BpSPL3基因的調(diào)節(jié)。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q943.2;S792.153
【部分圖文】：

通過(guò)ＣＴＡＢ法提取白樺組培苗葉片總ＲＮＡ，反轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ后，使用引物擴(kuò)增??和川基因的ＯＲＦ序列，菌液ＰＣＲ結(jié)果顯示分別在１４３７ｂｐ，??１１３４ｂｐ，?１４４６ｂｐ處有符合目的片段大小的單一目的條帶（圖２－１）。將膠回收后的目的??片段與Ｔ載體連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌液ＰＣＲ檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明ＰＣＲ擴(kuò)增出??的陽(yáng)性條帶符合目的片段大�。▓D２－２），隨機(jī)挑選２－３個(gè)陽(yáng)性菌液送公司測(cè)序，比對(duì)??結(jié)果顯示序列正確，結(jié)果表明５ｐＳＰｉ：３、和川基因Ｔ載體構(gòu)建成功。??＾＞ＳＰＬ３?ＢｐＳＰＬ９?ＢｐＳＰｔＷ??－?ｊＭ??ｌ０００ｂＰ??■?■?■??圖２－１辦ＳＰＺＪ、、辦尸基因克隆??Ｙｉｇ．２－＼?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＢｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９、ＢｐＳＰＬＩＯ?ｇｅｎｅ??－１２－??

通過(guò)ＣＴＡＢ法提取白樺組培苗葉片總ＲＮＡ，反轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ后，使用引物擴(kuò)增??和川基因的ＯＲＦ序列，菌液ＰＣＲ結(jié)果顯示分別在１４３７ｂｐ，??１１３４ｂｐ，?１４４６ｂｐ處有符合目的片段大小的單一目的條帶（圖２－１）。將膠回收后的目的??片段與Ｔ載體連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌液ＰＣＲ檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明ＰＣＲ擴(kuò)增出??的陽(yáng)性條帶符合目的片段大小（圖２－２），隨機(jī)挑選２－３個(gè)陽(yáng)性菌液送公司測(cè)序，比對(duì)??結(jié)果顯示序列正確，結(jié)果表明５ｐＳＰｉ：３、和川基因Ｔ載體構(gòu)建成功。??＾＞ＳＰＬ３?ＢｐＳＰＬ９?ＢｐＳＰｔＷ??－?ｊＭ??ｌ０００ｂＰ??■?■?■??圖２－１辦ＳＰＺＪ、、辦尸基因克隆??Ｙｉｇ．２－＼?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＢｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９、ＢｐＳＰＬＩＯ?ｇｅｎｅ??－１２－??

（四）ＢｐＳＰＬ３，?ＢｐＳＰＬ９，?ＢｐＳＰＬＩＯ蛋白質(zhì)親疏水性分析??蛋白質(zhì)的親疏水性是決定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的因素之一，一定程度上決定了蛋白的折??方式，因此在蛋白的特定功能上起著重要作用。我們使用ｐｒｏｔｓｃａｌｅ在線軟件對(duì)??ｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９和ＢｐＳＰＬＩＯ的氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析。小于零部分大于５０％??親水性蛋白，大于零部分大于５０％為疏水性蛋白，結(jié)果表明ＢｐＳＰＬ３，ＢｐＳＰＬ９，??ｐＳＰＬＩＯ的蛋白質(zhì)均為親水性蛋白（圖２－５）。??－１５－??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 劉闖;18個(gè)白樺SPLs基因的鑒定及BpSPL8基因的功能分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2017年

2 官民曉;白樺雌雄花序轉(zhuǎn)錄組分析及SEP1基因的功能鑒定[D];東北林業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2861689