寄生霜霉菌響應(yīng)遲發(fā)上調(diào)基因(Late up-regulated in response to Hyaloperonospora pa rasitica,LURP1)屬于LOR基因家族,在植物抵御卵菌屬(Oomycetes)病原菌的反應(yīng)和抗逆中起到關(guān)鍵作用。目前,對LURP1基因功能的研究仍不完善,且多局限于模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中,其在馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)中的研究尚未見報道。此外,迄今還沒有在任何物種中進(jìn)行LOR基因家族系統(tǒng)鑒定的報道。本實驗室的前期實驗中發(fā)現(xiàn)一個功能未知、但能與脫水響應(yīng)元件(Dehydration responsive element,DRE)相互作用的基因,經(jīng)本地序列基本搜索工具(Basic loocal alignment search tool,BLAST)比對,該基因為馬鈴薯StLURP1。本研究通過生物信息學(xué)手段在基因組水平上鑒定了馬鈴薯StLOR基因家族,同時重點關(guān)注與DRE元件相互作用的基因StLOR7。為了闡明馬鈴薯StLOR7基因的生物學(xué)功能、明確其在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的作用和其亞細(xì)胞定位情況,本研究構(gòu)建了過表達(dá)載體pBI121-StLOR7,并轉(zhuǎn)化馬鈴薯四倍體栽培品種“大西洋”;利用同源重組的定向克隆方式構(gòu)建了酵母(Saccharomyces cerevisiae)雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)誘餌載體pGBKT7-StLOR7,并篩選馬鈴薯cDNA文庫。取得的主要結(jié)果如下:1.鑒定出馬鈴薯StLOR基因家族中16個含有完整開放閱讀框和LOR結(jié)構(gòu)域的成員,根據(jù)它們的染色體分布將其重新命名為StLOR1-16;明確了StLORs的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白基序、在種內(nèi)及種間的系統(tǒng)發(fā)育情況;在StLORs的上游啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了多種與脅迫和激素相關(guān)的順式作用元件,暗示該家族能夠廣泛地響應(yīng)脅迫和植物激素處理;進(jìn)行了基于公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的StLOR基因家族在馬鈴薯不同組織中的分布情況和在不同脅迫及激素處理下的表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)StLOR基因家族成員在馬鈴薯不同組織中的分布具有特異性;此外,兩個StLOR成員能響應(yīng)熱脅迫(3、9);三個成員能響應(yīng)GA_3處理(1、2、12);StLOR11、12和StLOR1、2能夠分別響應(yīng)BAP和ABA處理;BABA處理時,StLOR14、15的表達(dá)量顯著升高,同時StLOR4、8、16下調(diào);StLOR5專一地響應(yīng)機(jī)械損傷。但StLORs的表達(dá)似乎不能被鹽和滲透脅迫誘導(dǎo)。2.通過實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢驗了StLOR基因家族16個成員在4種脅迫(滲透、干旱、冷、熱脅迫)及4種及激素(赤霉素、脫落酸、水楊酸和茉莉酸甲酯)處理下的表達(dá)模式。其中除StLOR13、14外,其余家族成員都能響應(yīng)鹽脅迫處理;StLOR2和StLOR13專一性地分別受鹽脅迫和冷脅迫誘導(dǎo);StLOR4、StLOR6和StLOR7受脫落酸的誘導(dǎo);StLOR1、3、5、15、16能響應(yīng)多種不同激素處理;StLOR8受熱脅迫誘導(dǎo)。本研究同時考察了StLOR7的相對表達(dá)量在上述8種處理下隨時間變化的趨勢,發(fā)現(xiàn)StLOR7僅能微弱地響應(yīng)熱脅迫、干旱脅迫和水楊酸處理,但其受到GA_3、MeJA和鹽脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo),其表達(dá)量在24 h時極顯著上調(diào),在48 h處達(dá)到最大值。3.構(gòu)建了由CaMV 35S啟動子驅(qū)動的過表達(dá)載體pBI121-StLOR7,并通過薯片轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化馬鈴薯四倍體栽培品種“大西洋”。經(jīng)過新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPT II的PCR檢驗和qRT-PCR檢驗,StLOR7已成功插入轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。4.本研究克隆了StLOR7基因的CDS區(qū),并通過同源重組的定向克隆方式構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-StLOR7。利用酵母的接合生殖使誘餌蛋白與cDNA文庫雜交并涂布高嚴(yán)謹(jǐn)篩選培養(yǎng)基,篩選得到126個候選陽性克隆,其中有88個單克隆能在染色篩選中水解顯色底物X-α-Gal,陽性率接近70%。經(jīng)測序得到含正確開放閱讀框的StLOR7互作蛋白12種,包括DnaJ家族蛋白、甘油磷酸二酯酶、多酚氧化酶、富脯氨酸蛋白、肌動蛋白解聚因子、重金屬轉(zhuǎn)運蛋白等�；プ鞯鞍椎幕虮倔w論(Gene Ontology,GO)注釋分析暗示StLOR7可能參與植物病原防御、脅迫響應(yīng)、重金屬解毒、微絲運動、脂類代謝、蛋白質(zhì)折疊與磷酸化等重要生物過程。初步明確了StLOR7蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S532
【部分圖文】：

圖 1.1 植物響應(yīng)脅迫的分子機(jī)制[3]Fig. 1.1 Molecular mechanism of plant response to stresses[3]例如在擬南芥中，熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)基因在植物受到生物脅迫、、鹽、熱和滲透脅迫時上調(diào)表達(dá)，但在線蟲病侵染和干旱的共同作用下下調(diào)[10-14]；衰關(guān)基因(Senescence-related genes)受熱和干旱脅迫的共同作用及病毒侵染的誘導(dǎo)[15,19]；相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins, PRS)在植物同時被病毒侵染和受熱脅迫時下調(diào)[15]；過氧化物酶(Peroxidase，POD)在植物受到冷、干旱、生物脅迫時表達(dá)量降低[17,18]生物合成基因(Ethylene biosynthesis genes)受到干旱、冷和鹽脅迫的誘導(dǎo)[19]；植物體內(nèi)A 的含量在干旱、冷、鹽和滲透脅迫下增加等[16]。2010 年，Mantri 等分析了鷹嘴豆對、寒冷、高鹽和壞死性真菌病原菌 Ascochyta rabiei 的反應(yīng)。結(jié)果表明，51 個基因能應(yīng) A. rabiei 而差異表達(dá)，其中 21 種基因同時受到 A. rabiei 和一種或多種非生物脅迫導(dǎo)，但沒有任何一個基因能同時響應(yīng)以上四種脅迫[20]。2013 年，Massa 等使用 RNA-Se鈴薯(Solanumtuberosum L.)進(jìn)行了深入的轉(zhuǎn)錄組分析，以研究馬鈴薯響應(yīng)生物脅迫[馬

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文的負(fù)調(diào)節(jié)因子起作用[75]。而，除了 LOR 的第一個成員 LURP1 之外，LOR 基因家族中的其他成員沒有病原防御相關(guān)的表達(dá)模式，這意味著它們的功能仍然是未知的[63]。本研究的目的和意義前，對 LURP1 基因功能的研究仍不完善，且多局限于模式植物擬南芥中，的研究尚未見報道。此外，迄今還沒有在任何物種中進(jìn)行 LOR 基因家族系統(tǒng)在這項研究中，我們在基因組水平上鑒定了馬鈴薯 StLOR 基因家族，同時重E 元件相互作用的基因 StLOR7，通過生物信息學(xué)分析、遺傳轉(zhuǎn)化、酵母雙雜對該基因進(jìn)行研究，以期明確其基因功能和在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的位置。技術(shù)路線

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文StLOR15-StLOR16 在 12 號染色體上形成 Cluster B。StLOR基因及其編碼蛋白的詳細(xì)信息列在表 2.2 中。預(yù)測的StLOR 蛋白長度范圍為127個氨基酸(StLOR16)至 235 個氨基酸(StLOR8)，意味著該基因家族成員之間存在結(jié)構(gòu)差異和功能多樣性。除 StLOR1(5.17)和 StLOR12(6.17)外，其他蛋白質(zhì)的理論 pI 均大于 7，為堿性蛋白，但 pI 變化較大，表明它們可能存在于細(xì)胞的不同分域中。親水平均值(GRAVY)的預(yù)測結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)大多數(shù)是親水的。StLOR4、5、7、8 和 StLOR15 分別位于葉綠體和線粒體中，而 StLOR14 可能參與分泌途徑。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，僅有 StLOR3 中存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域(未列出)，StLOR 基因家族成員均不含信號肽。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 房宸曦;馬鈴薯StLOR基因家族鑒定和StLOR7基因功能研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

本文編號：2861176