近年來,隨著傳統(tǒng)抗生素的不合理使用,致使殘留問題日益嚴(yán)重,耐藥菌株不斷出現(xiàn)。因此,尋找抗生素替代物迫在眉睫。抗菌肽是生物體在抵抗外來微生物入侵時產(chǎn)生的一類防御性小肽,因其獨特的優(yōu)勢有望成為抗生素的替代物。由于天然抗菌肽來源有限,從生物體內(nèi)提取步驟繁瑣,獲得產(chǎn)量不高;化學(xué)合成法雖然可大量獲得抗菌肽,但其合成成本相對較高;因此,通過基因工程實現(xiàn)抗菌肽的體外表達(dá)是今后的研究重點和發(fā)展方向�？咕腂SN-37是本實驗室具有自主知識產(chǎn)權(quán)的牛源抗菌肽,該抗菌肽是由37個氨基酸組成(序列為:FRPPIRRPPIRPPFYPPFRPPIRPPIFPPIRPPFRPP),分子量為3.3 kDa,前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該抗菌肽具有較好的抗菌活性。為了獲得高效的抗菌肽BSN-37,同時克服抗菌肽BSN-37對宿主細(xì)菌的破壞作用,本試驗采用融合表達(dá)的方式,在大腸桿菌中表達(dá)具有較好抑菌活性的抗菌肽BSN-37。根據(jù)抗菌肽BSN-37的氨基酸序列和大腸桿菌偏愛密碼子,反向翻譯出其基因片段,合成BSN-37基因,大小為126 bp,并將其克隆至PUC57載體中,命名為PUC-BSN-37。將原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和目的基因PUC-BSN-37經(jīng)BamH I和Xho I分別雙酶切后,通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α,構(gòu)建pGEX-6p-1-BSN-37重組質(zhì)粒,對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切以及測序鑒定;將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot檢測顯示:空載體工程菌在26 kDa處有明顯的標(biāo)簽蛋白GST的表達(dá),而含有BSN-37的融合蛋白在30 kDa處表達(dá)不明顯或表達(dá)量很低。為了提高抗菌肽BSN-37表達(dá)產(chǎn)量,本研究選擇了SUMO分子伴侶在大腸桿菌中表達(dá)抗菌肽,以PUC-BSN-37為模板,分別設(shè)計含有Xho I和Hind III雙酶切位點的上下游引物,擴增出目的基因BSN-37;將融合型表達(dá)載體pCold-SUMO與目的基因BSN-37經(jīng)Xho I和Hind III分別雙酶切后,通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α,構(gòu)建pCold-SUMO-BSN-37重組質(zhì)粒,并對重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR、雙酶切以及測序鑒定。將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒pCold-SUMO-BSN-37轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá),經(jīng)過對表達(dá)條件的優(yōu)化,摸索出表達(dá)的最佳條件。結(jié)果顯示:終濃度為0.4μM的IPTG在37℃、pH 7.2的條件下誘導(dǎo)6 h,表達(dá)效果最好。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,表達(dá)產(chǎn)物是以可溶性形式存在。由于BSN-37的N-端加了His標(biāo)簽,因而利用親和層析的方法進(jìn)行目的蛋白的純化,并通過SDS-PAGE和Western Blot對其表達(dá)量進(jìn)行檢測;將純化后的目的蛋白用SUMO蛋白酶在4℃酶切12 h獲得融合蛋白,經(jīng)過濃縮除鹽后再次進(jìn)行純化,獲得目的蛋白;通過雙層瓊脂擴散試驗對目的蛋白進(jìn)行活性檢測。結(jié)果顯示:上清液中檢測到的目的蛋白約為25 kDa,而標(biāo)簽蛋白大小約為19 kDa,與預(yù)期結(jié)果相符;酶切后的目的蛋白對沙門氏菌CVCC541具有良好的抑菌活性。綜上所述,本研究利用融合技術(shù)將抗菌肽BSN-37在大腸桿菌中獲得可溶性表達(dá),檢測到了相應(yīng)的抗菌活性,為進(jìn)一步研究牛源抗菌肽的表達(dá)以及開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

二硫鍵存在于兩個構(gòu)成β-折疊的肽段之間，起到穩(wěn)定抗菌肽結(jié)構(gòu)的作用，有助于抗菌肽穿過細(xì)胞膜（圖1-1A）。α-螺旋型抗菌肽：含有一個跨膜的α-螺旋結(jié)構(gòu)，其自身或者螺旋結(jié)構(gòu)聚合體介導(dǎo)抗菌肽誘發(fā)細(xì)菌內(nèi)容物的泄露，使細(xì)菌死亡（圖 1-1 B）。線性結(jié)構(gòu)抗菌肽：這類抗菌肽在 C-端有一個分子內(nèi)二硫鍵，形成一個環(huán)鏈結(jié)構(gòu)，而N-端則為線性結(jié)構(gòu)（圖 1-1 C）。圖 1-1 抗菌肽結(jié)構(gòu)分類示意圖。A：α-螺旋結(jié)構(gòu)；B：β-折疊結(jié)構(gòu)；C：線性結(jié)構(gòu)Fig 1-1 Structural classes of antimicrobial peptides .A:α-helical peptides; B:β-sheet peptides; C:extended peptides.1.2 抗菌肽的殺菌作用由于人類大量使用抗生素，導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，對整個社會造成嚴(yán)重的威脅。傳統(tǒng)抗生素的殺菌機制是使細(xì)菌細(xì)胞壁的合成受到阻礙，胞內(nèi) ATP 減少之后，細(xì)菌不能正常的呼吸而死亡[9]。目前，抗菌肽的殺菌機制有兩種，一種為胞外殺菌機制：抗菌肽可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，形成空洞，使細(xì)菌死亡。另一種為胞內(nèi)殺菌機制：抗菌肽破壞細(xì)胞膜后，進(jìn)入菌體內(nèi)與胞內(nèi)其他物質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。其中以胞外殺菌機制的研究最多，主要包括以下四種[10]：（1）“聚集體”模型（圖 1-2A）；（2）“環(huán)孔”模型（圖 1-2B）；（3）“桶板”模型（圖 1-2C）；（4）“地毯”模型（圖 1-2D）。

圖 1-2 抗菌肽作用機制[9]Fig l-2 Action mechanism of antibacterial peptides菌肽的應(yīng)用前景 1976 年首次成功地在大腸桿菌中表達(dá)重組人肽激素生長抑制素以來，究抗菌肽已經(jīng)成為趨勢。在此之前,只能從大量的動、植物組織或生物化少量的蛋白質(zhì)和酶。然而，隨著基因工程的迅速發(fā)展，大規(guī)模生產(chǎn)蛋。2010 年，保守估計全球食用動物生產(chǎn)中的抗生素消費量為 63 151 噸[1的 30 年里，新抗生素的批準(zhǔn)數(shù)量快速下降。因此，迫切需要開發(fā)新型抗菌.1 抗菌肽在醫(yī)藥方面的應(yīng)用年來，抗菌肽作為藥物載體被廣泛地推廣，有學(xué)者對抗菌肽在維護(hù)醫(yī)療也進(jìn)行了相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽在醫(yī)療應(yīng)用擁有眾多優(yōu)勢，因此，將

SUMO修飾化與去SUMO修飾化
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本文編號：2860670