乳酸菌是一類有益于宿主健康的微生物,主要通過在腸道中的定植發(fā)揮益生作用。乳酸菌對腸道上皮細胞的黏附、定植作用有助于恢復或增強腸道穩(wěn)態(tài),提高機體免疫力。因而乳酸菌的黏附能力是評價其益生性的重要指標。然而,有些具有益生功能的乳酸菌作用效果和穩(wěn)定性卻不盡如人意。所以篩選出一株黏附能力高,又具有免疫調節(jié)潛力的乳酸菌,對開發(fā)高效的免疫調節(jié)益生菌制劑尤為重要。本課題旨在從實驗室保藏的12株乳桿菌和2株耐久腸球菌中篩選出高黏附性乳酸菌,并分析影響該菌株黏附性的因素,對黏附機制進行初步探究。最后評價了該株高黏附乳酸菌對巨噬細胞RAW264.7的免疫調節(jié)作用。選取具有良好黏附性能的嗜酸乳桿菌NCFM作為對照,通過對14株不同種乳酸菌進行表面疏水性、自聚集能力以及體外黏附Caco-2細胞能力的測定,篩選出高黏附性乳酸菌菌株。并分析了表面性質與黏附性之間的關系。結果發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌KLDS 1.0901對Caco-2細胞的黏附率是受試的15株菌中最高的,為12.73%,且KLDS 1.0901具有僅次于耐久腸球菌KLDS6.0933的疏水率,為13.88%。鼠李糖乳桿菌KLDS1.0205的黏附能力最低,為0.13%。不同乳酸菌的表面疏水性與對Caco-2細胞的黏附能力呈現(xiàn)一定的相關性。采用體外實驗探究了高黏附性嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的濃度、生長階段、化學和酶處理對其黏附Caco-2細胞能力的影響。試驗結果表明,KLDS1.0901的生長階段顯著影響其黏附性。菌體濃度為10~8~10~(10) CFU/mL時,對黏附性影響不顯著。KLDS1.0901對Caco-2細胞的黏附可能是以表層蛋白為主的多種黏附素共同作用的結果。結合透射電鏡和SDS-PAGE技術,初步分離、鑒定了KLDS1.0901的表層蛋白。結果表明KLDS1.0901表面具有豐富的絨毛狀表層蛋白,含量約為15.6%,分子量大約為43 kDa。并證實表層蛋白粗提物能顯著抑制KLDS1.0901對Caco-2的黏附,且濃度越大,抑制作用越強。采用流式細胞術分析了未處理、去除表層蛋白和熱致死的KLDS1.0901在小鼠腸道中的定植與分布。結果表明,KLDS1.0901在灌胃前期主要黏附于十二指腸和空腸,后期KLDS1.0901趨向于黏附結腸。而去除表層蛋白和熱滅活的KLDS1.0901雖然在第一天能大量黏附于十二指腸,但是只能短暫停留于腸道各部位,隨著時間推移,這兩組在腸道各部位的黏附量顯著減少。從體內證實了KLDS1.0901也能在小鼠腸道內長時間黏附定植,并且其表面的表層蛋白同樣能顯著影響其在體內的黏附能力。體外探究了高黏附菌株KLDS1.0901對巨噬細胞RAW264.7的免疫調節(jié)作用。測定了不同劑量的未處理KLDS1.0901(LLA)、去除表層蛋白KLDS1.0901(RSLA)和熱致死的KLDS1.0901(HKLA)對巨噬細胞增殖能力及吞噬作用的影響;以及刺激巨噬細胞后IL-10和TNF-α分泌水平及其對應mRNA的表達量。試驗結果表明:當菌體與巨噬細胞以10:1和1:1共同孵育時,LLA和HKLA組均能顯著促進巨噬細胞的增殖,但只有LLA能顯著促進巨噬細胞的吞噬活性。在所有濃度下,RSLA組均顯著抑制了巨噬細胞活性。并證實KLDS1.0901表面的表層蛋白是增強巨噬細胞活性的重要物質,當以500μg/mL的表層蛋白粗品刺激巨噬細胞時,其增殖和吞噬活性最強。KLDS1.0901與巨噬細胞以1000:1共同孵育時,與空白對照組相比,LLA顯著抑制了IL-10和TNF-的分泌。其他濃度條件下:LLA,RSLA和HKLR組IL-10的分泌水平均顯著高于對照組,但遠低于LPS組;LLA、RSLA和HKLA能夠誘導細胞分泌與LPS組相同水平的TNF-α。與空白對照組相比,當菌體與巨噬細胞以100:1共培養(yǎng)時,LLA和HKLA均能顯著上調IL-10和TNF-mRNA表達水平。這與細胞因子水平的測定結果相佐證。結論為篩選得到一株表層蛋白含量豐富、黏附性高和具有免疫調節(jié)潛力的嗜酸乳桿菌KLDS1.0901。該菌株有作為粘膜疫苗載體使用的潛能,亦可開發(fā)成高效調節(jié)機體免疫的益生菌。
【學位單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.3
【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 立題背景
    1.2 文獻綜述
        1.2.1 乳酸菌在人和動物體內的分布
        1.2.2 益生乳酸菌的黏附作用研究進展
        1.2.3 巨噬細胞的免疫功能
        1.2.4 乳酸菌的黏附與免疫調節(jié)的關系
    1.3 研究目的及意義
    1.4 主要研究內容
    1.5 課題來源
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗菌株
        2.1.2 試驗細胞
        2.1.3 試驗動物
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 試劑與來源
        2.1.6 儀器設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌株的培養(yǎng)與保藏
        2.2.2 Caco-2 細胞培養(yǎng)與保藏
        2.2.3 RAW264.7 細胞培養(yǎng)與保藏
        2.2.4 高黏附性乳酸菌的篩選
        2.2.5 影響乳酸菌黏附性的因素分析
        2.2.6 KLDS1.0901對RAW264.7 免疫活性的影響
        2.2.7 數(shù)據(jù)分析
3 結果與分析
    3.1 高黏附性乳酸菌的篩選
        3.1.1 乳酸菌的疏水性
        3.1.2 乳酸菌的自凝聚能力
        3.1.3 乳酸菌對Caco-2 細胞的黏附能力
        3.1.4 乳酸菌對Caco-2 黏附觀察
        3.1.5 乳酸菌表面疏水性與黏附性相關性分析
    3.2 影響嗜酸乳桿菌KLDS1.0901 黏附性的因素分析
        3.2.1 濃度對黏附性的影響
        3.2.2 生長階段對黏附性的影響
        3.2.3 化學和酶處理對黏附的影響
        3.2.4 表層蛋白的分離鑒定
        3.2.5 表層蛋白對KLDS1.0901 黏附性的影響
        3.2.6 體內黏附試驗
    3.3 KLDS1.0901對RAW264.7 免疫活性的影響
        3.3.1 KLDS1.0901對RAW264.7 細胞增殖能力的影響
        3.3.2 KLDS1.0901對RAW264.7 細胞吞噬活性的影響
        3.3.3 SLP粗品對巨噬細胞增殖的影響
        3.3.4 SLP粗品對巨噬細胞吞噬活性的影響
        3.3.5 不同處理KLDS1.0901 對細胞因子IL-10和TNF-的影響
        3.3.6 IL-10和TNF-mRNA的相對表達量
4 討論
    4.1 高黏附性乳酸菌的篩選
        4.1.1 乳酸菌的表面性質與黏附性的關系
        4.1.2 不同乳酸菌對Caco-2 細胞模型的黏附能力
    4.2 影響KLDS1.0901 黏附性的主要因素分析
        4.2.1 乳酸菌的濃度與生長期對黏附性的影響
        4.2.2 KLDS1.0901 的表層蛋白對黏附性的影響
    4.3 KLDS1.0901 對巨噬細胞免疫活性的影響
        4.3.1 KLDS1.0901 對巨噬細胞活性的影響
        4.3.2 KLDS1.0901 對巨噬細胞分泌細胞因子水平的影響
5 結論
致謝
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文

【參考文獻】

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1 陳金龍;張月巧;袁婭;吳素蕊;明建;;植物多糖通過NF-κB信號通路對巨噬細胞的免疫調節(jié)作用研究進展[J];食品科學;2015年23期

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本文編號：2858553