木質素是一種復雜致密、非常穩(wěn)定的網狀結構物質,也是非常難降解的天然芳香族聚合物,是地球上繼植物多糖纖維素后第二大豐富的生物可再生資源,木質素的降解不僅關乎到造紙等行業(yè)的發(fā)展,同時也影響著可再生性能源利用的發(fā)展。白腐菌因其特有的細胞外降解酶系,是迄今為止最有效、最主要的木質素降解微生物,可徹底降解木質素成為CO2和水,白腐菌對木質纖維基質的降解在自然界的碳素循環(huán)中起著關鍵作用,可為其他微生物類群提供大量易于吸收的植物多糖類物質,同時白腐菌對木質素的降解也是以綠色、無污染的方式進行。偏腫革裥菌(Lenzitesgibbosa)是我國東北林區(qū)常見的一種多孔菌科(Polyporaceae)白腐菌,生長在多種闊葉樹的倒木、枯立木或活立木上,引起木材海綿狀白色腐朽,也是一種生長速度較快、對木材和木質素分解能力較強的白腐菌,為了在分子層面上深入探索L.gibbosa降解木材和木質素的機理,本文利用HiSeq高通量測序技術對在木質和非木質條件下5個時間點的L.gibosa菌體樣本進行了轉錄組測序,對差異表達的基因進行了功能注釋與富集分析,對降解木質素的關鍵酶基因和關鍵通路進行了挖掘,并利用熒光定量PCR對重要的關鍵基因進行了表達量驗證,主要研究結果如下:1、對在楊樹木屑、水稻稻草、玉米秸稈3種不同木質纖維基質下的L.gibbo木質素降解酶系統進行了酶活檢測,結果表明3種不同木質纖維基質均能使L.gibbosa的漆酶(laccase)和錳過氧化物酶(MnP)活性提高,其中木屑對2種酶活的促進作用最為明顯,稻草次之、秸稈最差,這與3者成分中木質素含量排序一致(木質素含量楊樹木屑最高、水稻稻草次之、秸稈最低)。在30d的檢測時間內,木屑組的2種酶活始終保持增長,而秸稈組和稻草組的酶活在試驗后期出現波動甚至降低。以上數據揭示了L.gibbosa降解不同類型木質基質時酶的活性變化規(guī)律,為后續(xù)結合轉錄組測序數據聯合分析找到木質素降解酶關鍵基因奠定了基礎。2、利用HiSeq高通量測序技術,對L.gibbosa在木質和非木質條件處理下的菌絲體進行了轉錄組測序與分析,從轉錄水平分析了L.gibbosa對木材與木質素降解的相關生物過程與代謝途徑,結果表明 L.gibbosa對木材與木質素的分解代謝與氧化還原反應過程密切相關、與木質素分解等生物過程密切相關,與碳代謝、芳香化合物降解等通路密切相關。本研究得到一條與木質素降解有關的COG分類關鍵類目Q類(Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism),一條木質素降解基因本體(Gene Ontology)關鍵類目(term):G00046274(Lignin catabolic process),一條木質素降解關鍵通路ko01220(Degradation of aromatic compounds);通過表達量差異分析、差異表達基因的功能注釋與分析,進一步得到一系列與木質素降解有關的關鍵酶及基因:NAD-P 結合結構域蛋白酶、NADP-dependent alcohol dehydrogenase 6(含 GroES2 域)、CYP450、Alcohol dehydrogenase(含 GroES1 域)、MnP2、MnP3、Versatile peroxidase VPL1(VP,MnP10s)、MrP1、Laccase D、Laccasel、LiP9、LiP2 等,為最終篩選L.gibbosa降解木質素的關鍵酶基因縮小了范圍,為后續(xù)開展功能基因研究奠定了基礎。3、結合轉錄組測序與酶活檢測數據,進行加權基因共表達網絡構建與分析,得到與漆酶和MnP相關的2個基因模塊,即turquoise模塊和blue模塊。利用統計學方法得到 blue模塊的82個關鍵基因(hub gene),turquoise模塊的261個hub genes,在這些hub genes中,利用COG、GO、KEGG注釋分析,進一步縮小關鍵基因范圍,結合轉錄組差異分析,確定了最終的11個關鍵基因:gene 14284、gene 11466、gene_1 1537、gene 3902、gene 5357、gene_6568、gene_713、gene_7760、gene 7855、gene 7857、gene 8611。4、對篩選到的11個L.gibbosa木質素降解關鍵酶基因進行qPCR檢測,選擇木屑、稻草、秸稈3種底物處理,結果表明木屑組的基因表達差異最為顯著,秸稈與稻草組次之,這些基因在不同類型的纖維基質中都差異表達,表明它們都為L.gibbosa降解木質素的關鍵基因。5、通過RT-PCR技術克隆了 L gibbosa三條基因即mnpl0s(VP)、laccase D、cyp450,分析得到mnp10s(VP)基因CDS全長1089bp,編碼362個氨基酸,含有“l(fā)igninase”保守結構域,屬于plant peroxidase超家族蛋白;laccase D基因CDS全長1608bp,編碼 535 個氨基酸,含有“CouRO 1 Tv-LCC like”和“CouRO 3 Tv-LCC like”兩個保守結構域,屬于Cupredoxin超家族蛋白;cyp450-up1基因CDS全長2001bp,編碼666個氨基酸,屬于P450超家族蛋白。以上研究為完整揭示偏腫革裥菌降解木材與木質素的機理奠定了重要的分子基礎。
【學位單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

分差異明顯，針葉木質素中愈創(chuàng)木基丙烷的含量最高，而在闊葉木質素中紫丁香基丙烷??和愈創(chuàng)木基丙烷的含量都比較大，但對羥苯基丙烷含量卻相對較小三種丙烷的結??構式見圖１－１。??〒?ｃ?ｃ??＊?ｉ?Ｉ??Ｖ?ｃ?ｃ??｜?Ｉ?Ｉ??。?ｃ＊?ｒ??ＡＡＡ??ｉ?Ｉ?ｆ?］??〇ＣＨ３?Ｈ３ｃｏ／Ｎ＾ｉｘ〇ＣＨ＞??〇Ｈ?ＯＨ?ＯＨ??愈創(chuàng)木基內＇烷?紮丁香綦丙烷?對好笨＊丙烷??圖１－１木質素三種丙烷結構式??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｆｏｒｍｕｌａ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｐｒｏｐａｎｅ?ｉｎｌｉｇｎｉｎ??１．２．２木質素的生物降解??近年來，現代工業(yè)的急速發(fā)展一方面給人類帶來了許多便利，另一方面也造成了不??少讓人困擾的新問題，其中，尤以能源短缺和生態(tài)環(huán)境污染最為棘手。為了解決這兩個??制約人類社會可持續(xù)發(fā)展的關鍵難題，許多國家在節(jié)能減排的同時不斷嘗試開發(fā)新能??－３?－??

因為每瓶菌株的起始活性并不相同，所以不能將同一時間不同基質下的酶活數據進??行橫向比較。所以為了明確分析三種木質纖維基質對Ｚ．?產ＭｎＰ的影響程度，將??不同處理下ＭｎＰ活性較起始值變化的倍數作為標準，繪制折線圖２－５。如圖所示，隨著??培養(yǎng)時間的延長，不加任何基質的空白對照組ＭｎＰ活性幾乎沒有變化，倍數波動范圍??為０．６８？１．３２倍；變化最顯著的是加入木肩的處理組，倍數變化范圍為卜２８．６４倍；ＤＣ??組倍數變化范圍為Ｉ？３．３５倍；ＪＧ組倍數變化范圍為Ｎ２．９９倍。??？Ｔ?Ｍ??Ｐ?５?－ｅｒ??ｉｒ！士．??２?３“．??＊?１?ｔ?…？?＊?０＾－＾ｒ－??？??－＇?ｒ—ｒ－？－￣？??ｉＫｔ?ｖｉ?？?ｎ?．■?ｒ＃?ｉ？?ｒ＊?■?打?／．■ｓｒｉ?／＞＾ｒｉ??Ｈ］＇ｉｒ，?－ｒ．?Ｔｉｍｅｄ??？?－？?■?？?—■—??圖２－５?ＭｎＰ活性變化倍數??

因為每瓶菌株的起始活性并不相同，所以不能將同一時間不同基質下的酶活數據進??行橫向比較。所以為了明確分析三種木質纖維基質對Ｚ．?產ＭｎＰ的影響程度，將??不同處理下ＭｎＰ活性較起始值變化的倍數作為標準，繪制折線圖２－５。如圖所示，隨著??培養(yǎng)時間的延長，不加任何基質的空白對照組ＭｎＰ活性幾乎沒有變化，倍數波動范圍??為０．６８？１．３２倍；變化最顯著的是加入木肩的處理組，倍數變化范圍為卜２８．６４倍；ＤＣ??組倍數變化范圍為Ｉ？３．３５倍；ＪＧ組倍數變化范圍為Ｎ２．９９倍。??？Ｔ?Ｍ??Ｐ?５?－ｅｒ??ｉｒ！士．??２?３“．??＊?１?ｔ?…？?＊?０＾－＾ｒ－??？??－＇?ｒ—ｒ－？－￣？??ｉＫｔ?ｖｉ?？?ｎ?．■?ｒ＃?ｉ？?ｒ＊?■?打?／．■ｓｒｉ?／＞＾ｒｉ??Ｈ］＇ｉｒ，?－ｒ．?Ｔｉｍｅｄ??？?－？?■?？?—■—??圖２－５?ＭｎＰ活性變化倍數??
【參考文獻】

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本文編號：2852666