發(fā)布時間：2020-10-21 11:57

　　 M23家族蛋白酶具有內(nèi)肽酶和酰胺酶活性,能降解細菌細胞壁肽聚糖,作為新型的蛋白類抗生素倍受關注。部分噬菌體裂解酶屬M23家族蛋白酶,能高效地裂解多重耐藥性細菌,使其有望應用于取代傳統(tǒng)的抗生素治療。本文在已獲得騰沖熱海棲熱菌噬菌體TSP4基因組的基礎上,分析此噬菌體裂解酶基因的基本特征,對裂解酶基因進行克隆表達,同時探索利用高溫酶熱穩(wěn)定性高的特點,建立基于菌體熱裂解的重組裂解酶快速純化方法,并通過抑菌活性和AFM觀察評價純化后裂解酶的活性。最后將裂解酶用可溶性淀粉吸附制備成酶制劑,定期評價酶制劑的酶活變化。為了探索裂解酶的裂解機理,本文分別利用革蘭氏陰性菌大腸桿菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的肽聚糖,與裂解酶進行反應,研究其對肽聚糖的吸附特征,通過液質(zhì)聯(lián)用分析裂解酶水解肽聚糖的位點,并進一步通過對裂解酶基因的定點突變,驗證裂解酶的活性位點及特征。為了探索裂解酶的抑菌效果,本文通過致死率分析及電鏡觀察,評價裂解酶對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和多重耐藥肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果。并通過在小鼠身上制造了皮膚傷口,定殖耐藥金黃色葡萄球菌隨后用TSPpgh對局部進行治療,探索裂解酶在治療多重耐藥金黃色葡萄球菌在外傷感染中的作用。結(jié)果表明,棲熱菌噬菌體TSP4裂解酶TSPpgh屬于M23肽酶家族,推測motif HXXXD和HXH為TSPpgh的活性位點,并進行了突變驗證。將裂解酶基因TSPpgh克隆表達后,得到分子量19 KDa的重組蛋白。通過對誘導表達后的發(fā)酵液升溫至55℃并維持20分鐘,能使細胞破裂并變性沉淀去除掉絕大多數(shù)表達菌株大腸桿菌的蛋白,從而實現(xiàn)裂解酶的快速純化,結(jié)合高密度發(fā)酵技術,發(fā)酵液中裂解酶濃度可達2 mg/mL。裂解酶對金黃色葡萄球菌ATCC 6538的殺菌效率最高,可達90%。通過AFM觀察表明,TSPpgh裂解了大腸桿菌BL21(含TSPpgh質(zhì)粒)和金黃色葡萄球菌的細胞壁,制備的酶制劑在20℃保存一年其酶活能保持75%。裂解酶TSPpgh能夠吸附和水解革蘭氏陰性菌和陽性菌的肽聚糖,并且能夠水解彈性蛋白。通過液質(zhì)聯(lián)用分析TSPpgh水解肽聚糖的位點表明,TSPpgh還能夠水解糖苷鍵Glcp-β-1’-6’-Glcp-β-1’-1’,具有糖苷酶的活性。抑菌實驗表明,TSPpgh在37℃、酶濃度為68μg/mL的濃度下,裂解酶TSPpgh對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌CMCC(B)50094和大腸桿菌CMCC(B)44102菌株的致死率達90%,對多重耐藥肺炎克雷伯氏菌的致死率高達80%以上,部分致死率可達100%;通過SEM觀察表明,裂解酶TSPpgh通過裂解作用而實現(xiàn)其殺菌功能。本研究在小鼠身上制造了皮膚傷口,定殖耐藥金黃色葡萄球菌2612-1606BL1486,隨后用TSPpgh對局部進行治療。在為期9天的治療期間,TSPpgh和卡那霉素均快速的促進了傷口愈合。驗證了裂解酶TSPpgh在治療多重耐藥金黃色葡萄球菌在外傷感染中的作用。本文建立了高溫裂解酶的高效表達和快速純化方法,結(jié)合此裂解酶較廣泛的細菌裂解譜、較高的裂解酶活性以及熱穩(wěn)定性,使其具有較好的生產(chǎn)應用前景,其對多重耐藥菌良好的殺滅效果,有助于其作為新型的酶抗生素應用于醫(yī)藥研發(fā)。
【學位單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q55
【部分圖文】：

昆明理工大學2圖1.1長尾科噬菌體電鏡形態(tài)[2]圖1.2肌尾科噬菌體電鏡形態(tài)[2]Fig1.1.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.2.ElectronmicroscopicmorphologyofSpihoviuseofMyoviridae圖1.3絲狀科噬菌體電鏡形態(tài)[2]圖1.4覆層噬菌體電鏡形態(tài)[2]Fig1.3.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.4.ElectronmicroscopicmorphologyofInoviridaeofTectiviridae多年來對騰沖熱海嗜熱菌的研究，證明了以嗜熱菌和藻類墊為代表的微生物區(qū)系和群落結(jié)構的多樣性。嗜熱噬菌體的研究將進一步豐富和擴大人們對該地區(qū)微生物多樣性的認識。嗜熱微生物是一類生活在高溫環(huán)境中的微生物，如火山口及其周圍區(qū)域、溫泉、工廠高溫廢水排放區(qū)等。近30年來，這一類微生物越來越廣泛地引起了科學家們的重視和興趣。特別是在水的沸點和沸點以上溫度條件下能生活的細菌被發(fā)現(xiàn)后，更促進了對嗜熱微生物的研究。極端微生物具有理論研究價值，且有著誘人的生物技術開發(fā)前景，關于這類生物的研究已經(jīng)成為微生物學研究中的一大熱點，極端微生物噬菌體由于其獨特的生物學地位，在生命的進化與起源中可能扮演著舉足輕重的作用，加之對其的研究可能蘊含著巨大的應用價值，因此加快高溫菌噬菌體研究的步伐成為不少研究者共同的愿望。

昆明理工大學2圖1.1長尾科噬菌體電鏡形態(tài)[2]圖1.2肌尾科噬菌體電鏡形態(tài)[2]Fig1.1.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.2.ElectronmicroscopicmorphologyofSpihoviuseofMyoviridae圖1.3絲狀科噬菌體電鏡形態(tài)[2]圖1.4覆層噬菌體電鏡形態(tài)[2]Fig1.3.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.4.ElectronmicroscopicmorphologyofInoviridaeofTectiviridae多年來對騰沖熱海嗜熱菌的研究，證明了以嗜熱菌和藻類墊為代表的微生物區(qū)系和群落結(jié)構的多樣性。嗜熱噬菌體的研究將進一步豐富和擴大人們對該地區(qū)微生物多樣性的認識。嗜熱微生物是一類生活在高溫環(huán)境中的微生物，如火山口及其周圍區(qū)域、溫泉、工廠高溫廢水排放區(qū)等。近30年來，這一類微生物越來越廣泛地引起了科學家們的重視和興趣。特別是在水的沸點和沸點以上溫度條件下能生活的細菌被發(fā)現(xiàn)后，更促進了對嗜熱微生物的研究。極端微生物具有理論研究價值，且有著誘人的生物技術開發(fā)前景，關于這類生物的研究已經(jīng)成為微生物學研究中的一大熱點，極端微生物噬菌體由于其獨特的生物學地位，在生命的進化與起源中可能扮演著舉足輕重的作用，加之對其的研究可能蘊含著巨大的應用價值，因此加快高溫菌噬菌體研究的步伐成為不少研究者共同的愿望。

昆明理工大學2圖1.1長尾科噬菌體電鏡形態(tài)[2]圖1.2肌尾科噬菌體電鏡形態(tài)[2]Fig1.1.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.2.ElectronmicroscopicmorphologyofSpihoviuseofMyoviridae圖1.3絲狀科噬菌體電鏡形態(tài)[2]圖1.4覆層噬菌體電鏡形態(tài)[2]Fig1.3.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.4.ElectronmicroscopicmorphologyofInoviridaeofTectiviridae多年來對騰沖熱海嗜熱菌的研究，證明了以嗜熱菌和藻類墊為代表的微生物區(qū)系和群落結(jié)構的多樣性。嗜熱噬菌體的研究將進一步豐富和擴大人們對該地區(qū)微生物多樣性的認識。嗜熱微生物是一類生活在高溫環(huán)境中的微生物，如火山口及其周圍區(qū)域、溫泉、工廠高溫廢水排放區(qū)等。近30年來，這一類微生物越來越廣泛地引起了科學家們的重視和興趣。特別是在水的沸點和沸點以上溫度條件下能生活的細菌被發(fā)現(xiàn)后，更促進了對嗜熱微生物的研究。極端微生物具有理論研究價值，且有著誘人的生物技術開發(fā)前景，關于這類生物的研究已經(jīng)成為微生物學研究中的一大熱點，極端微生物噬菌體由于其獨特的生物學地位，在生命的進化與起源中可能扮演著舉足輕重的作用，加之對其的研究可能蘊含著巨大的應用價值，因此加快高溫菌噬菌體研究的步伐成為不少研究者共同的愿望。
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本文編號：2850089