體細胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)又稱為克隆,是目前動物細胞工程領域一種研究細胞重編程常用的技術手段,可以將終末分化的細胞重新編程為具有全能性狀態(tài)的細胞,并發(fā)育為同質(zhì)個體后代。盡管核移植技術在重編程研究中具有安全和可獲得全能性細胞的優(yōu)點,但是在多數(shù)動物中重編程的效率仍然非常低,大部分克隆胚胎在早期發(fā)育期間會發(fā)生發(fā)育阻滯。研究表明克服表觀遺傳障礙是目前提高重編程效率的重要策略,其中關鍵組蛋白甲基化H3K9me3、H3K27me3已經(jīng)被明確標記為重編程表觀屏障,而關于DNA甲基化分子標記物的報導卻很少,急需通過組學方法進行挖掘分析。本文的研究中,我們分析了不同發(fā)育命運克隆胚胎與正常受精胚胎的DNA甲基化譜,發(fā)現(xiàn)克隆胚胎與正常受精胚胎相比在全局去甲基化的過程中表現(xiàn)出甲基化較高的特點,我們進一步對差異甲基化區(qū)域(Differentially Methylated Regions,DMRs)進行分析并識別出克隆胚胎中三種異常的甲基化模式,包括重新甲基化的DMRs(rDMRs)、持續(xù)甲基化的DMRs(pDMRs)和去甲基化的DMRs(dDMRs)。另外,我們發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域、第一內(nèi)含子和3'UTR是DMRs重點分布的基因組功能區(qū)域,并且DMRs的長度與DNA甲基化水平的差異明顯的負相關,DMRs長度越短,DNA甲基化水平變化越大�？寺∨咛ポ^高的甲基化水平導致早期合子基因組基因、多能性維持因子以及關鍵轉(zhuǎn)錄因子未正確激活,這是克隆胚胎重編程失敗的重要原因。之后,我們聯(lián)合轉(zhuǎn)錄RNA-seq數(shù)據(jù)進行綜合分析,鑒定出SCNT中高DNA甲基化與基因表達下調(diào)的基因簇,這些基因的低表達會引起克隆胚胎發(fā)育脫離正常軌道。進一步我們通過構(gòu)建加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡識別出一系列關鍵重編程表觀障礙因子,包括Sp110、Sp140、Pcgf5、Zfp207、Ubtfl1、Serbp1、Dppa2、Yy1、Prps1、Rrn3、Obox6、Kpna2、Elovl6、Trim13、Katna1等。其中Dppa2、Obox6、Pcgf5、Yy1、Rrn3等已被證實是體細胞重編程中關鍵基因,對促進細胞重編程的進程有重要作用。最后,我們對細胞重編程中甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt家族)和去甲基化酶(Tet家族)進行了系統(tǒng)的比較分析,研究發(fā)現(xiàn)Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b在克隆胚胎中基因表達水平升高,而Tet家族中,只有Tet1基因表達水平下降,這表明克隆胚胎的高甲基化可能是由Dnmt家族的高表達和Tet1的低表達共同造成的。本研究全面地分析了克隆胚胎全基因組DNA甲基化的異常模式,為克服重編程中DNA甲基化表觀遺傳屏障,提高重編程效率提供了一定的理論支持,對于后期體細胞核移植的臨床應用具有一定的幫助。
【學位單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q813
【部分圖文】：

細胞編程與重編程.1 細胞編程細胞編程的過程實際上是細胞不斷分化并喪失全能性的過程。在哺乳動物中，細胞的編于受精卵細胞。由于受精的過程，卵母細胞染色體數(shù)目加倍，重新激活了處于靜止期（M2細胞。經(jīng)過多次快速的有絲分裂形成了大量的卵裂球，而由于卵裂速度快，并處于保護質(zhì)殼（透明帶）中，來不及伴隨細胞體積和物質(zhì)增加，因此核質(zhì)指數(shù)不斷升高，卵裂速慢或停滯，直到從透明帶中孵出才能繼續(xù)發(fā)育。隨著卵裂球的致密化，形成實心細胞團為桑椹胚（morula），以模型動物小鼠為例，大約發(fā)育到 3.5 天左右，桑椹胚形成空心結(jié)分化為兩個細胞群體：內(nèi)細胞團（Inner Cell Mass, ICM）和滋養(yǎng)層（Trophectoderm, TE）為囊胚。其中滋養(yǎng)層是胚胎胎盤成分的前體，而包裹充滿液體的內(nèi)細胞團，包含原始內(nèi)，和更深層的多能外胚層細胞，它們是胎兒發(fā)育的祖細胞來源（圖 1-1）。

圖 1-2 不同重編程技術示意圖[8]Fig 1-2 Schematic diagram of different reprogramming techniques[8]傳學的研究技術與方法學是對可遺傳表型變化的研究，這種變化是由改變基礎 DNA 序是在染色質(zhì)修飾的背景下進行。表觀遺傳修飾作用在染色質(zhì)的高控，進而影響基因的轉(zhuǎn)錄表達。表觀遺傳學這一名詞最初是由 W基因的物理性質(zhì)及其在遺傳中的作用尚不清楚，因此很難解釋表觀遺傳學是經(jīng)典遺傳學的另一方面，提供基因時空特異性表達的指白共價修飾、染色質(zhì)可及性的調(diào)節(jié)，可以實現(xiàn)基因選擇性轉(zhuǎn)錄；要是由基因組中的非編碼 RNA 實現(xiàn)的。這些所有的表觀遺傳修飾

圖 2-1 數(shù)據(jù)分析流程Fig. 2-1 Data analysis process.2 數(shù)據(jù)的下游分析.2.1 差異甲基化位點與差異表達基因分析首先進行差異 DNA 甲基化分析，剔除覆蓋度小于 3 的 CpG 位點，剩余位點作為有pG 位點用于之后的分析。定義| β|>0.2，wilcoxon 秩和檢驗 p-value <0.05 的 CpG 位點 DNA 甲基化位點，其中 p-value 越小認為差異顯著性越高。對于差異基因分析，首先剔除了樣品中所有重復樣本 FPKM< 0.1 的基因，剩余的基是表達的基因。差異表達分析使用 R 包 DEseq2 進行，定義差異倍數(shù)大于 2 倍差異og2FC > 1 為上調(diào)，log2FC < -1 為下調(diào)，并且 q-value< 0.05 為差異表達基因。q-value -value 矯正的結(jié)果。
【相似文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 曹鵬波;小鼠克隆胚胎重編程的DNA甲基化模式分析與表觀標記挖掘[D];內(nèi)蒙古大學;2019年

2 楊勝楠;泛癌癥DNA甲基化模式分析[D];西安電子科技大學;2017年

本文編號：2844032