發(fā)布時(shí)間：2020-10-09 03:42

　　 蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(Bacillus thuringiensis var.israelensis,Bti)是用于防治蚊、蚋等病媒生物的重要生物因子,但實(shí)際應(yīng)用中存在毒力水平不夠高、持效期短等問(wèn)題。Sigma K(σK)因子在芽胞桿菌中能夠控制芽胞形成、母細(xì)胞裂解等,同時(shí)通過(guò)Sigma(σ)因子間的級(jí)聯(lián)調(diào)控,影響殺蟲(chóng)蛋白的形成。本文通過(guò)構(gòu)建缺失σK因子的Bti突變菌株,研究了 sigK缺失對(duì)Bti生產(chǎn)菌株Bt-59的影響,為構(gòu)建高毒力活性、持效期長(zhǎng)的工程菌提供參考。主要研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了 Bt-59的sigK缺失突變菌株Bt59(△sigK):通過(guò)對(duì)Bt-59菌株全基因組測(cè)序分析,確定sigK基因的位于Genomel 05261,大小為714bp,編碼237個(gè)氨基酸,與已報(bào)道的其他Bt亞種相似性均為100%。通過(guò)擴(kuò)增sigK基因同源臂構(gòu)建敲除載體pMADAsigK,電擊轉(zhuǎn)化Bt-59感受態(tài)菌株,篩選獲得同源重組缺失sigK突變株Bt59(△sigK);克隆包含sigK基因及其啟動(dòng)子區(qū)域的1495 bp的片段PsigK-sigK,利用pHT315表達(dá)載體連接PsigK-sigK,轉(zhuǎn)化突變株Bt59(△sigK)中構(gòu)建獲得sigK的恢復(fù)菌株 Bt59(HFsigK)。(2)明確了sig 突變對(duì)Bt-59菌株芽胞形成的作用:Bt59(△sigK)的營(yíng)養(yǎng)期生長(zhǎng)與原菌株Bt-59無(wú)明顯差異,但培養(yǎng)后期觀察不到芽胞的形成;而sigK基因恢復(fù)菌株Bt59(HFsigK)恢復(fù)了芽胞的形成,其總細(xì)胞數(shù)和芽胞數(shù)分別為4.64×107 CFU/mL 和 3.33×106 CFU/mL,與原菌株 2.43×106 CFU/mL 芽胞量相當(dāng),說(shuō)明 sigK基因的缺失導(dǎo)致Bt-59菌株失去形成芽胞的能力。sigK缺失同時(shí)影響到Bti母細(xì)胞的裂解,使母細(xì)胞完全裂解時(shí)間從T25延長(zhǎng)到T60,而B(niǎo)t59(HFsigK)則又使細(xì)胞裂解速度恢復(fù)到原菌株水平。(3)分析了sig 突變對(duì)Bt-59殺蟲(chóng)蛋白形成和殺蟲(chóng)活性的影響B(tài)t59(△sigX)培養(yǎng)后期能正常形成殺蟲(chóng)晶體蛋白,晶體形態(tài)及其大小未發(fā)生明顯變化。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明,sigK突變影響了 Bt-59菌株中不同殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá)量,Bt59(△sigK)中Cry4Aa/4Ba蛋白表達(dá)量提高了約1.67倍,Cyt1Aa蛋白提高了約1.21倍,而Cry1 1Aa蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯差異。生測(cè)結(jié)果表明,Bt59(△sigK)對(duì)淡色庫(kù)蚊(Culexpipienspallens)的殺蟲(chóng)活性略微降低,而對(duì)白紋伊蚊(Aedesalbopictus)的殺蟲(chóng)活性則無(wú)明顯影響。(4)sigK突變對(duì)Bt-59水解酶CwlC的影響:克隆并原核表達(dá)了 Bt-59菌株732 bp的cwlC片段,細(xì)胞壁裂解試驗(yàn)表明CwlC具有水解細(xì)胞壁活性。通過(guò)擴(kuò)增617 bp cwlC啟動(dòng)子區(qū)域(PBcwIC)連接pHT304-18Z得到重組載體pHTPBcwlC,電擊轉(zhuǎn)化Bt59(△sigK)菌株中構(gòu)建了 BcwlC-lacZ表達(dá)菌株Bt59(△sigK)(PBcwlc-lacZ)。lacZ活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)在Bt59(△sigK)中沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性,表明Bt-59 cwlC基因受sigK基因的控制。通過(guò)比較Bt庫(kù)斯塔克亞種HD73母細(xì)胞裂解基因,Bt-59 CwlC能夠恢復(fù)HD(△cwlC)的表型,說(shuō)明Bt-59 CwlC具有水解功能。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q78
【部分圖文】：

１．１蘇云金芽胞桿菌（Ｂｔ）逡逑蘇云金芽胞桿菌（５ａｃ／／／ｉ？lMＢｔ）是一種特異且安全的微生物殺蟲(chóng)劑，在逡逑形成芽胞時(shí)可產(chǎn)生一種或多種對(duì)相應(yīng)昆蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)作用的晶體蛋白（ＩＣＰｓ）（圖１－１）邋Ｗ。逡逑大多數(shù)Ｂｔ菌株包含一種晶體，例如庫(kù)斯塔克亞種ＨＤ７３菌株只包含一種菱形晶體（圖１－１）逡逑［２】；還發(fā)現(xiàn)少數(shù)菌株包含多個(gè)晶體，例如以色列亞種Ｂｔｉ菌株含有至少四種晶體（圖１－２）逡逑晶體的著色能力與細(xì)胞類(lèi)似，易與芽胞分開(kāi)識(shí)別［４，５］。目前Ｂｔ菌株主要研宄的殺蟲(chóng)蛋逡逑白包括Ｃｒｙ／Ｃｙｔ晶體蛋白和Ｖｉｐ分泌蛋白Tj而對(duì)Ｓｉｐ分泌蛋白的報(bào)道極少逡逑＊逡逑ＣｒｙｌｌＡ．＿＿．ｍｍ邐Ｗ＊逡逑圖１－１芽胞和晶體（左圖ＨＤ７３［２】，右圖Ｂｔｉ【３】）逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｐｏｒｅ邋ａｎｄ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ｏｆ邋Ｂｔｉ邋（ＨＤ７３【２】邋ｏｎ邋ｌｅｆｔ邋ａｎｄ邋Ｂｔｉ［３］邋ｏｎ邋ｒｉｇｈｔ）逡逑我國(guó)從１９５５年首次對(duì)Ｂｔ進(jìn)行正式報(bào)道［９］，至今己６０多年；從收集資源、鑒定菌種等逡逑初期研宄，到如今分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等多技術(shù)協(xié)同應(yīng)用，不斷有新的未知逡逑基因被發(fā)現(xiàn)，新的成果層出不窮。截止２０１７年，根據(jù)一類(lèi)有效成分分型，我國(guó)己經(jīng)歸類(lèi)逡逑登記的Ｂｔ類(lèi)農(nóng)藥產(chǎn)品包括２２６種

邐［２５］、Ｂｔ莫里遜（ｗｏｒｒ＾ｏｗ／）亞逡逑種以及杰加西坦（火ｇ如心似《）亞種等菌株［２６］，也被廣泛研宄。Ｂｔｉ具有傳統(tǒng)Ｂｔ菌株的一般逡逑特點(diǎn)，并可以產(chǎn)生多種晶體蛋白，至少包括四種主效蛋白和２種次要蛋白（圖１－３）【２７］；逡逑而蚊蟲(chóng)對(duì)Ｂｔｉ不易產(chǎn)生抗性則主要?dú)w因于其主效蛋白之間的不同作用模式和協(xié)同作用［２８】。逡逑１．２．２邋Ｂｔｉ殺蟲(chóng)蛋白逡逑Ｂｔｉ邋菌株形成的主要蛋白為邋Ｃｉｙ４Ａａ邋（ｐＢｔｌｌＯ）、Ｃｒｙ４Ｂａ邋（ｐＢｔ０３８）、ＣｒｙｌｌＡａ邋（ｐＢｔ０２３）逡逑和ＣｙｔｌＡａ邋（ｐＢｔ０２１）（圖１－２），最初發(fā)現(xiàn)這四種蛋白都位于同一質(zhì)粒ｐＢｔｏｘｉｓ邋（邋１２８邋ｋｂ）逡逑上，另外在質(zhì)粒邋ｐＢｔｏｘｉｓ邋上還發(fā)現(xiàn)邋Ｃｒｙｌ０Ａａ（ｐＢｔ０４７）、Ｃｙｔ２Ｂａ邋（ｐＢｔ０３６）和邋ＣｙｔｌＣａ邋（ｐＢｔ０５４）逡逑三種次要蛋白（圖１－２）邋［２９］。逡逑”。逡逑４邋ｆｒ＼＼％逡逑１＾２邋＼邋？ｂｐ逡逑圖１－２質(zhì)粒ｐＢｔｏｘｉｓ圖譜【２９］逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｍａｐ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＢｔｏｘｉｓ【２９】逡逑

１．３調(diào)控芽胞形成的主要轉(zhuǎn)錄因子逡逑最初證明在枯草芽胞桿菌沿，Ｂｓ）中主要的轉(zhuǎn)錄因子（ＳｐｏＯＡ、ｏＨ、ａＦ、ｇｅ、逡逑ｇｇ、ｃｊｋ）存在級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)機(jī)制（圖１－３）邋［５５］，后期又證明在蘇云金芽胞桿菌［５６］與梭狀芽胞桿逡逑菌屬（Ｃ／Ｍｒ妨ｗｍｓｐｐ．）中也存在類(lèi)似的機(jī)制；雖然它們之間的調(diào)節(jié)機(jī)制很大程度上相似，逡逑但也存在許多差異『５７］。芽胞的形成涉及７個(gè)發(fā)育階段（圖１－３）：早期營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的發(fā)育，逡逑細(xì)胞的不對(duì)稱隔膜、前芽胞、芽胞皮層、芽胞衣逐步依次形成，最終芽胞成熟，細(xì)胞裂解逡逑并將芽胞釋放［２，％。如圖在形成芽胞之前由ＳｐｏＯＡ和ｃｊｈ調(diào)控，芽胞在早期主要受＃和￥逡逑因子的控制，而在晚期主要受和ａＫ因子的控制：在前芽胞中依次主要受＃和＃因子的逡逑控制，而在母細(xì)胞中依次主要受ｃｒＥ和＃因子的控制［５５１。前一個(gè)0因子的激活都是為后一個(gè)0逡逑因子的激活做鋪墊，以此形成級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)［５仇逡逑ＯｒｐＫｆｔｆｉ邋ＨＫｓ邐？備逡逑＠備邋廣邋Ｐｔｘｗｐｈｏ＾ｌａｙ逡逑－？邐－＊＜ｅｌｈｂｒ逡逑ｊｊ邐ｆｕｎａｌｏｍ逡逑ｊＴ￣邐ｊ逡逑？ＪＢＩ逡逑Ｆｏｍｐｏｒｔ邐｜｜邐Ｍｏｔｈａｒ邐ｃｍＵ逡逑圖１－３芽胞桿菌中ｃｊ級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)機(jī)制Ｍ逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋ａ邋ｃａｓｃａｄｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｉｎ邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ＾逡逑ｃ因子可調(diào)節(jié)許多ｃ＾ｙ／ｃ聲基因的表達(dá)（表１－２）。研究發(fā)現(xiàn)

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5 周q

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