發(fā)布時間：2020-10-09 03:42

　　 蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(Bacillus thuringiensis var.israelensis,Bti)是用于防治蚊、蚋等病媒生物的重要生物因子,但實際應(yīng)用中存在毒力水平不夠高、持效期短等問題。Sigma K(σK)因子在芽胞桿菌中能夠控制芽胞形成、母細胞裂解等,同時通過Sigma(σ)因子間的級聯(lián)調(diào)控,影響殺蟲蛋白的形成。本文通過構(gòu)建缺失σK因子的Bti突變菌株,研究了 sigK缺失對Bti生產(chǎn)菌株Bt-59的影響,為構(gòu)建高毒力活性、持效期長的工程菌提供參考。主要研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了 Bt-59的sigK缺失突變菌株Bt59(△sigK):通過對Bt-59菌株全基因組測序分析,確定sigK基因的位于Genomel 05261,大小為714bp,編碼237個氨基酸,與已報道的其他Bt亞種相似性均為100%。通過擴增sigK基因同源臂構(gòu)建敲除載體pMADAsigK,電擊轉(zhuǎn)化Bt-59感受態(tài)菌株,篩選獲得同源重組缺失sigK突變株Bt59(△sigK);克隆包含sigK基因及其啟動子區(qū)域的1495 bp的片段PsigK-sigK,利用pHT315表達載體連接PsigK-sigK,轉(zhuǎn)化突變株Bt59(△sigK)中構(gòu)建獲得sigK的恢復(fù)菌株 Bt59(HFsigK)。(2)明確了sig 突變對Bt-59菌株芽胞形成的作用:Bt59(△sigK)的營養(yǎng)期生長與原菌株Bt-59無明顯差異,但培養(yǎng)后期觀察不到芽胞的形成;而sigK基因恢復(fù)菌株Bt59(HFsigK)恢復(fù)了芽胞的形成,其總細胞數(shù)和芽胞數(shù)分別為4.64×107 CFU/mL 和 3.33×106 CFU/mL,與原菌株 2.43×106 CFU/mL 芽胞量相當(dāng),說明 sigK基因的缺失導(dǎo)致Bt-59菌株失去形成芽胞的能力。sigK缺失同時影響到Bti母細胞的裂解,使母細胞完全裂解時間從T25延長到T60,而Bt59(HFsigK)則又使細胞裂解速度恢復(fù)到原菌株水平。(3)分析了sig 突變對Bt-59殺蟲蛋白形成和殺蟲活性的影響B(tài)t59(△sigX)培養(yǎng)后期能正常形成殺蟲晶體蛋白,晶體形態(tài)及其大小未發(fā)生明顯變化。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明,sigK突變影響了 Bt-59菌株中不同殺蟲蛋白的表達量,Bt59(△sigK)中Cry4Aa/4Ba蛋白表達量提高了約1.67倍,Cyt1Aa蛋白提高了約1.21倍,而Cry1 1Aa蛋白的表達量無明顯差異。生測結(jié)果表明,Bt59(△sigK)對淡色庫蚊(Culexpipienspallens)的殺蟲活性略微降低,而對白紋伊蚊(Aedesalbopictus)的殺蟲活性則無明顯影響。(4)sigK突變對Bt-59水解酶CwlC的影響:克隆并原核表達了 Bt-59菌株732 bp的cwlC片段,細胞壁裂解試驗表明CwlC具有水解細胞壁活性。通過擴增617 bp cwlC啟動子區(qū)域(PBcwIC)連接pHT304-18Z得到重組載體pHTPBcwlC,電擊轉(zhuǎn)化Bt59(△sigK)菌株中構(gòu)建了 BcwlC-lacZ表達菌株Bt59(△sigK)(PBcwlc-lacZ)。lacZ活性測定發(fā)現(xiàn)在Bt59(△sigK)中沒有轉(zhuǎn)錄活性,表明Bt-59 cwlC基因受sigK基因的控制。通過比較Bt庫斯塔克亞種HD73母細胞裂解基因,Bt-59 CwlC能夠恢復(fù)HD(△cwlC)的表型,說明Bt-59 CwlC具有水解功能。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

１．１蘇云金芽胞桿菌（Ｂｔ）逡逑蘇云金芽胞桿菌（５ａｃ／／／ｉ？lMＢｔ）是一種特異且安全的微生物殺蟲劑，在逡逑形成芽胞時可產(chǎn)生一種或多種對相應(yīng)昆蟲具有殺蟲作用的晶體蛋白（ＩＣＰｓ）（圖１－１）邋Ｗ。逡逑大多數(shù)Ｂｔ菌株包含一種晶體，例如庫斯塔克亞種ＨＤ７３菌株只包含一種菱形晶體（圖１－１）逡逑［２】；還發(fā)現(xiàn)少數(shù)菌株包含多個晶體，例如以色列亞種Ｂｔｉ菌株含有至少四種晶體（圖１－２）逡逑晶體的著色能力與細胞類似，易與芽胞分開識別［４，５］。目前Ｂｔ菌株主要研宄的殺蟲蛋逡逑白包括Ｃｒｙ／Ｃｙｔ晶體蛋白和Ｖｉｐ分泌蛋白Tj而對Ｓｉｐ分泌蛋白的報道極少逡逑＊逡逑ＣｒｙｌｌＡ．＿＿．ｍｍ邐Ｗ＊逡逑圖１－１芽胞和晶體（左圖ＨＤ７３［２】，右圖Ｂｔｉ【３】）逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｐｏｒｅ邋ａｎｄ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ｏｆ邋Ｂｔｉ邋（ＨＤ７３【２】邋ｏｎ邋ｌｅｆｔ邋ａｎｄ邋Ｂｔｉ［３］邋ｏｎ邋ｒｉｇｈｔ）逡逑我國從１９５５年首次對Ｂｔ進行正式報道［９］，至今己６０多年；從收集資源、鑒定菌種等逡逑初期研宄，到如今分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等多技術(shù)協(xié)同應(yīng)用，不斷有新的未知逡逑基因被發(fā)現(xiàn)，新的成果層出不窮。截止２０１７年，根據(jù)一類有效成分分型，我國己經(jīng)歸類逡逑登記的Ｂｔ類農(nóng)藥產(chǎn)品包括２２６種

邐［２５］、Ｂｔ莫里遜（ｗｏｒｒ＾ｏｗ／）亞逡逑種以及杰加西坦（火ｇ如心似《）亞種等菌株［２６］，也被廣泛研宄。Ｂｔｉ具有傳統(tǒng)Ｂｔ菌株的一般逡逑特點，并可以產(chǎn)生多種晶體蛋白，至少包括四種主效蛋白和２種次要蛋白（圖１－３）【２７］；逡逑而蚊蟲對Ｂｔｉ不易產(chǎn)生抗性則主要歸因于其主效蛋白之間的不同作用模式和協(xié)同作用［２８】。逡逑１．２．２邋Ｂｔｉ殺蟲蛋白逡逑Ｂｔｉ邋菌株形成的主要蛋白為邋Ｃｉｙ４Ａａ邋（ｐＢｔｌｌＯ）、Ｃｒｙ４Ｂａ邋（ｐＢｔ０３８）、ＣｒｙｌｌＡａ邋（ｐＢｔ０２３）逡逑和ＣｙｔｌＡａ邋（ｐＢｔ０２１）（圖１－２），最初發(fā)現(xiàn)這四種蛋白都位于同一質(zhì)粒ｐＢｔｏｘｉｓ邋（邋１２８邋ｋｂ）逡逑上，另外在質(zhì)粒邋ｐＢｔｏｘｉｓ邋上還發(fā)現(xiàn)邋Ｃｒｙｌ０Ａａ（ｐＢｔ０４７）、Ｃｙｔ２Ｂａ邋（ｐＢｔ０３６）和邋ＣｙｔｌＣａ邋（ｐＢｔ０５４）逡逑三種次要蛋白（圖１－２）邋［２９］。逡逑”。逡逑４邋ｆｒ＼＼％逡逑１＾２邋＼邋？ｂｐ逡逑圖１－２質(zhì)粒ｐＢｔｏｘｉｓ圖譜【２９］逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｍａｐ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＢｔｏｘｉｓ【２９】逡逑

１．３調(diào)控芽胞形成的主要轉(zhuǎn)錄因子逡逑最初證明在枯草芽胞桿菌沿，Ｂｓ）中主要的轉(zhuǎn)錄因子（ＳｐｏＯＡ、ｏＨ、ａＦ、ｇｅ、逡逑ｇｇ、ｃｊｋ）存在級聯(lián)調(diào)節(jié)機制（圖１－３）邋［５５］，后期又證明在蘇云金芽胞桿菌［５６］與梭狀芽胞桿逡逑菌屬（Ｃ／Ｍｒ妨ｗｍｓｐｐ．）中也存在類似的機制；雖然它們之間的調(diào)節(jié)機制很大程度上相似，逡逑但也存在許多差異『５７］。芽胞的形成涉及７個發(fā)育階段（圖１－３）：早期營養(yǎng)體細胞的發(fā)育，逡逑細胞的不對稱隔膜、前芽胞、芽胞皮層、芽胞衣逐步依次形成，最終芽胞成熟，細胞裂解逡逑并將芽胞釋放［２，％。如圖在形成芽胞之前由ＳｐｏＯＡ和ｃｊｈ調(diào)控，芽胞在早期主要受＃和￥逡逑因子的控制，而在晚期主要受和ａＫ因子的控制：在前芽胞中依次主要受＃和＃因子的逡逑控制，而在母細胞中依次主要受ｃｒＥ和＃因子的控制［５５１。前一個0因子的激活都是為后一個0逡逑因子的激活做鋪墊，以此形成級聯(lián)調(diào)節(jié)［５仇逡逑ＯｒｐＫｆｔｆｉ邋ＨＫｓ邐？備逡逑＠備邋廣邋Ｐｔｘｗｐｈｏ＾ｌａｙ逡逑－？邐－＊＜ｅｌｈｂｒ逡逑ｊｊ邐ｆｕｎａｌｏｍ逡逑ｊＴ￣邐ｊ逡逑？ＪＢＩ逡逑Ｆｏｍｐｏｒｔ邐｜｜邐Ｍｏｔｈａｒ邐ｃｍＵ逡逑圖１－３芽胞桿菌中ｃｊ級聯(lián)調(diào)節(jié)機制Ｍ逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋ａ邋ｃａｓｃａｄｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｉｎ邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ＾逡逑ｃ因子可調(diào)節(jié)許多ｃ＾ｙ／ｃ聲基因的表達（表１－２）。研究發(fā)現(xiàn)

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