自結(jié)合肽(SBP)是一種位于單體蛋白質(zhì)內(nèi)部具有獨立結(jié)構(gòu)和功能的短肽片段,通過一條柔性連接區(qū)域(linker)與母體蛋白其余部分相連,并動態(tài)地與該母體蛋白特定區(qū)域(靶標)發(fā)生可調(diào)節(jié)的復(fù)合和解離(association and disassociation)。這是一種兼具蛋白質(zhì)折疊(folding)和結(jié)合(binding)特征的生物分子現(xiàn)象。眾所周知,蛋白質(zhì)的折疊是新生肽鏈獲得其生物學功能的重要過程。一般來說,該折疊發(fā)生在單一多肽鏈上。對于SBP現(xiàn)象,由于其與靶標區(qū)域序列的連續(xù)性人們通常很自然地將之歸于折疊的范疇,即把它視為單體蛋白折疊事件的最后一步。然而,SBP與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)折疊又有顯著的差異,如SBP可動態(tài)復(fù)合/解離以及表現(xiàn)出分子開關(guān)功能等,這些都是典型的結(jié)合特征。因此,從表觀上來看SBP具備折疊和結(jié)合的雙重特征。為了弄清SBP折疊-結(jié)合耦合(coupled folding and binding)的分子機制,本研究對多個典型且具有代表性的SBP單體蛋白進行了系統(tǒng)地分子動力學模擬和熱力學分析,包括原癌基因產(chǎn)物Vav、人類視黃酸受體RARγ、果蠅模架蛋白INAD和14-3-3蛋白Cp14b。首先,人工切斷了結(jié)合狀態(tài)下SBP的linker區(qū)域獲得了游離的SBP肽段,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了人工非結(jié)合狀態(tài)的SBP/靶標復(fù)合物體系;進而,分別對SBP游離肽段、人工復(fù)合物體系、天然結(jié)合體系進行了動力學模擬,并對比分析了不同體系的動力學行為、熱力學性質(zhì)以及相關(guān)的焓熵效應(yīng)。此外,我們還采用原癌基因產(chǎn)物Vav內(nèi)部SBP結(jié)合狀態(tài)下的天然晶體結(jié)構(gòu)為模板,將其SBP部分與靶標連接的linker區(qū)域人為切斷,從而搭建了斷開的SBP/靶標復(fù)合物體系,并對其進行系統(tǒng)的動力學研究,進而對比分析了有無linker區(qū)域?qū)BP結(jié)合方式的影響。研究表明:一方面,SBP可以視為經(jīng)典蛋白質(zhì)折疊(folding)的一個環(huán)節(jié),它通過蛋白質(zhì)內(nèi)部分子相互作用而實現(xiàn)與母體蛋白其他部分綁定;另一方面,通過切斷l(xiāng)inker對比研究發(fā)現(xiàn),SBP/靶標相互作用的熱力學性質(zhì)并不會受到顯著影響,因此在分子水平上SBP與普通肽/蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合(binding)情況并無本質(zhì)區(qū)別。鑒于此,我們認為SBP是受傳統(tǒng)意義上蛋白“折疊”驅(qū)使的分子內(nèi)“結(jié)合”現(xiàn)象,可以視為一種新型的折疊-結(jié)合耦合行為,即“伴隨折疊的結(jié)合(binding-upon-folding)”,其與先前人們針對普通肽/蛋白質(zhì)復(fù)合物體系提出的“伴隨結(jié)合的折疊(folding-upon-binding)”互為反向過程。此外,我們還發(fā)現(xiàn)盡管linker區(qū)域并不會顯著影響SBP/靶標相互作用的熱力學性質(zhì),但能有效促進SBP與靶標之間的動態(tài)接觸幾率,從而在動力學水平提高二者之間的結(jié)合效率,這與普通肽/蛋白質(zhì)復(fù)合物體系的“folding-upon-binding”又有本質(zhì)區(qū)別,因此SBP可視為一類介于折疊和結(jié)合之間的新型生物分子現(xiàn)象。我們分析了SBP序列的殘基組成傾向,發(fā)現(xiàn)它與傳統(tǒng)無定型態(tài)蛋白(intrinsically disordered protein)中的結(jié)構(gòu)混亂區(qū)域的氨基酸組成較為相似,但二者的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能實現(xiàn)方式存在較大區(qū)別,因此不能將之簡單歸屬于無定型態(tài)蛋白之列。
【學位單位】：電子科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q51
【部分圖文】：

電子科技大學碩士學位論文與所在單體蛋白中的其他特定區(qū)域（靶標）進行動態(tài)復(fù)合和解離來動態(tài)調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)的生物學功能。在一個 SBP 系統(tǒng)中，SBP 片段一方面可以特異性地識別其靶標區(qū)域并與之相互作用，在復(fù)合態(tài)和解離態(tài)之間建立動態(tài)平衡，從而實現(xiàn) SBP 與靶標的空間獨立性；另一方面，該 SBP 又通過一個柔性多肽連接環(huán)（linker）與其靶標相連，從而實現(xiàn)二者序列的共享性（見圖 1-1[8]）。從而使得 SBP 兼具“結(jié)合”和“折疊”的特征。

電子科技大學碩士學位論文這四種單體蛋白系統(tǒng)均源于不同物種，它們的三維空間結(jié)構(gòu)以及生物學功能也各不相同。對于四個單體蛋白系統(tǒng)中的 SBP 區(qū)段，它們的序列、構(gòu)象以及結(jié)合模式也不盡相同。這使得我們所選樣本具有多樣性和代表性。這些蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)是通過溶液核磁共振（NMR）或 X 射線晶體學解析得到的。我們從 PDB數(shù)據(jù)庫中獲取到的這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)均為天然的 SBP 結(jié)合狀態(tài)（如圖 2-1 所示）。

第二章 自結(jié)合肽的折疊特性其所在的 SBP 區(qū)段占據(jù)這個蛋白質(zhì)的肽結(jié)合口袋，從而調(diào)控 Cp14b 與其天然肽配體之間的復(fù)合和解離。2.2.2 自結(jié)合肽-靶標非結(jié)合狀態(tài)的人工構(gòu)建我們所使用的四個 SBP 單體蛋白系統(tǒng)的晶體結(jié)構(gòu)均為結(jié)合狀態(tài)。我們使用了一種經(jīng)驗方法來構(gòu)建這四個單體蛋白系統(tǒng)的 SBP 非結(jié)合狀態(tài)結(jié)構(gòu)。首先，我們根據(jù)基于結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻報告確定了每個系統(tǒng)中 SBP 區(qū)段的具體殘基序列[7, 8]。然后，如圖 2-2 所示，人工切斷 SBP 區(qū)段與母體蛋白之間的 linker，使得其最鄰近的兩個殘基從母體蛋白脫離下來（a）。接著對每個 SBP 切斷的 N 端或 C 端分別用乙�；�-Ac）和氨基（ NH2）進行封端基處理。

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