昆蟲的變態(tài)發(fā)育是昆蟲與環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)、協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果,受激素、營(yíng)養(yǎng)和基因的精確調(diào)控,在此過(guò)程中有多重因子協(xié)同發(fā)揮作用。近年來(lái),非編碼小分子RNA(microRNA)在昆蟲中的研究表明,其對(duì)昆蟲的變態(tài)發(fā)育具有顯著的調(diào)控作用。但在模式昆蟲赤擬谷盜中,對(duì)microRNA參與發(fā)育事件的研究仍鮮有報(bào)道,對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制也需要進(jìn)一步闡明。本論文中利用miRNA類似物、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、雙鏈干擾以及解剖學(xué)觀察等實(shí)驗(yàn)手段對(duì)miR-375-3p及其靶基因Ptdlns-P2-Ptase進(jìn)行了功能分析,并對(duì)其在赤擬谷盜中的作用機(jī)制有了一個(gè)初步探討。首先,通過(guò)注射miR-375-3p類似物上調(diào)其表達(dá)進(jìn)而探討其在蛹到成蟲的調(diào)控作用。miR-375-3p類似物處理組跟對(duì)照組比,處理晚期蛹組阻礙了蛹到成蟲的發(fā)育過(guò)程,并引起致死效應(yīng),順利羽化為成蟲后也存在羽化缺陷;順利進(jìn)入成蟲期后發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,成蟲產(chǎn)卵量下降,且解剖后發(fā)現(xiàn)卵巢發(fā)育有缺陷,卵巢管受精卵的數(shù)量明顯少于對(duì)照組。其次,為研究miR-375-3p對(duì)赤擬谷盜的變態(tài)發(fā)育過(guò)程中羽化和生殖的調(diào)控,使用3個(gè)預(yù)測(cè)軟件PicTar,miRanda,Targetscan對(duì)miR-375-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),分別得到的結(jié)果中選取交集,且按匹配值以及種子序列及結(jié)合前期候選靶基因功能研究,最終篩選出3個(gè)預(yù)測(cè)靶基因,它們分別為:Eip63E,Pkn,Ptdlns-P2-Ptase。隨即對(duì)候選靶基因構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體,進(jìn)行體外驗(yàn)證,結(jié)果表明Ptdlns-P2-Ptase是miR-375-3p真正的靶基因,跟對(duì)照組相比,只有Ptdlns-P2-Ptase的熒光素酶活性下降70%左右。最后,為了進(jìn)一步探討miR-375-3p和其靶基因Ptdlns-P2-Ptase對(duì)赤擬谷盜發(fā)育的調(diào)控作用,我們對(duì)其靶基因的體內(nèi)功能進(jìn)行研究。在晚期蛹進(jìn)行Ptdlns-P2-Ptase RNAi,顯示了與注射miR-375-3p類似物后相似的生物學(xué)表型,盡管Ptdlns-P2-Ptase的敲減對(duì)赤擬谷盜變態(tài)發(fā)育的影響更為顯著。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了Ptdlns-P2-Ptase是miR-375-3p的靶基因。與此同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)注射miR-375-3p類似物和敲減Ptdlns-P2-Ptase時(shí),蛻皮激素通路上的關(guān)鍵基因Br-c,E74,EcR,E93的表達(dá)量與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異;與此相對(duì)的是,保幼激素通路上的轉(zhuǎn)錄因子Kr-h1的表達(dá)量明顯升高。這些結(jié)果表明miR-375-3p和Ptdlns-P2-Ptase都參與調(diào)控赤擬谷盜保幼激素通路,從而影響羽化和生殖。綜上所述,作為赤擬谷盜在晚期蛹低表達(dá),早期成蟲特異高表達(dá)的miRNA之一,miR-375-3p調(diào)控蛹的正常發(fā)育,并參與了赤擬谷盜變態(tài)發(fā)育中的羽化和生殖過(guò)程,證明了時(shí)期特異性miRNAs存在潛在的生物學(xué)意義。此外,miR-375-3p通過(guò)其靶基因Ptdlns-P2-Ptase影響雙信使信號(hào)通路對(duì)保幼激素信號(hào)分子的傳遞效率,從而參與調(diào)控赤擬谷盜羽化和生殖過(guò)程。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q965
【部分圖文】：

移入培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每天在固定時(shí)間觀察表型并拍8h 后各取三只進(jìn)行總 RNA 提取，用以檢測(cè)干擾效率化的成蟲在 5 天后進(jìn)行雌雄配對(duì)，預(yù)交配 3 天后，正化情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)束后解剖成蟲，觀察生殖腺的發(fā)育情與分析-3p 在赤擬谷盜不同時(shí)期表達(dá)模式期通過(guò)微流體芯片實(shí)驗(yàn)得到 miR-375-3p 在晚期幼蟲、達(dá)模式，并用熒光定量 PCR 進(jìn)一步補(bǔ)充了赤擬谷盜八早期成蟲特異高表達(dá)，而在其他時(shí)期相對(duì)低表達(dá)，成蟲暗示 miR-375-3p 在成蟲羽化的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用蛹順利羽化變成成蟲。第二章 miR-375-3p 對(duì)赤擬谷盜羽化和生殖的影響

以加入特異的 miR-375-3p 逆轉(zhuǎn)錄引物得到的 cDNA 作為模板，定量 PCR 檢測(cè) miR-375-3p 的表達(dá)量。注射 miR-375-3p mimics 后，定量結(jié)果顯示赤擬谷盜體內(nèi)miR-375-3p 的表達(dá)水平明顯上升（圖 2.2A），可以對(duì) miR-375-3p 進(jìn)行獲得性研究。2.4.2.2 晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 導(dǎo)致羽化缺陷在晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 后，觀察發(fā)現(xiàn)蛹不能成功羽化為成蟲，而且出現(xiàn)了兩種表現(xiàn)，一種是停滯在蛹—成蟲的中間形態(tài)，隨后死亡，此比例占 25%，另一種表型是羽化后翅膀存在缺陷，鞘翅不能合攏，這種比例占到了 35%，還有一部分正常羽化（圖 2.2C-D）。晚期蛹注射 miR-375-3pmimics 改變了蛹期到成蟲期 miR-375-3p 的表達(dá)模式，蛹不能正常羽化，由此我們推測(cè) miR-375-3p 在蛹期低表達(dá)，成蟲期高表達(dá)是使赤擬谷盜羽化階段所必須的。2.4.2.3 晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 引起生殖缺陷將羽化成功的成蟲進(jìn)行雌雄交配，觀察發(fā)現(xiàn)跟野生組或者 NC 對(duì)照組相比，成蟲產(chǎn)卵量下降（圖 2.2B），不影響孵化，解剖后發(fā)現(xiàn)生殖腺存在發(fā)育缺陷（圖 2.2E）。這一結(jié)果表明，改變 miR-375-3p 的正常表達(dá)模式，將影響赤擬谷盜的生殖。

圖 3.3 miR-375-3p 與候選靶基因在 3’UTR 區(qū)的一個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)因雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)結(jié)果構(gòu)建靶基因的雙熒光素酶報(bào)告基因載體進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證序列的報(bào)告基因載體，與 miR-375-3p mimics 共轉(zhuǎn)染進(jìn)黑照組，第一組為實(shí)驗(yàn)組：miR-375-3p mimics 、 Pac-pG為對(duì)照組：miR-375-3p mimics、Pac-pGL3 空載質(zhì)粒、PRL的活性，每個(gè) miRNA 與靶基因設(shè)置三次技術(shù)重復(fù)，兩次現(xiàn) Tc002125 熒光值明顯下降（圖 3.4C），而 TC002523、現(xiàn)顯著的下調(diào)作用（圖 3.4A-B）。為確定 Tc002125 確定計(jì)突變基因 Tc002125-mut，進(jìn)行雙熒光實(shí)驗(yàn)。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組375-3pmimics、Pac-pGL3 重組質(zhì)粒、PRL；實(shí)驗(yàn)組 2：miR-37t 重組質(zhì)粒、PRL；對(duì)照組：miR-375-3p mimics、Pac-pGL3測(cè)熒光素酶的活性，每個(gè) miRNA 與靶基因設(shè)置三次技術(shù)果如圖 3.4D ，確定了 Tc002125 也就是 Ptdlns-P2-Ptase 基

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本文編號(hào)：2819262