昆蟲的變態(tài)發(fā)育是昆蟲與環(huán)境長期適應(yīng)、協(xié)同進化的結(jié)果,受激素、營養(yǎng)和基因的精確調(diào)控,在此過程中有多重因子協(xié)同發(fā)揮作用。近年來,非編碼小分子RNA(microRNA)在昆蟲中的研究表明,其對昆蟲的變態(tài)發(fā)育具有顯著的調(diào)控作用。但在模式昆蟲赤擬谷盜中,對microRNA參與發(fā)育事件的研究仍鮮有報道,對其具體的調(diào)控機制也需要進一步闡明。本論文中利用miRNA類似物、雙熒光素酶報告實驗、雙鏈干擾以及解剖學(xué)觀察等實驗手段對miR-375-3p及其靶基因Ptdlns-P2-Ptase進行了功能分析,并對其在赤擬谷盜中的作用機制有了一個初步探討。首先,通過注射miR-375-3p類似物上調(diào)其表達進而探討其在蛹到成蟲的調(diào)控作用。miR-375-3p類似物處理組跟對照組比,處理晚期蛹組阻礙了蛹到成蟲的發(fā)育過程,并引起致死效應(yīng),順利羽化為成蟲后也存在羽化缺陷;順利進入成蟲期后發(fā)現(xiàn),與對照組相比,成蟲產(chǎn)卵量下降,且解剖后發(fā)現(xiàn)卵巢發(fā)育有缺陷,卵巢管受精卵的數(shù)量明顯少于對照組。其次,為研究miR-375-3p對赤擬谷盜的變態(tài)發(fā)育過程中羽化和生殖的調(diào)控,使用3個預(yù)測軟件PicTar,miRanda,Targetscan對miR-375-3p進行靶基因預(yù)測,分別得到的結(jié)果中選取交集,且按匹配值以及種子序列及結(jié)合前期候選靶基因功能研究,最終篩選出3個預(yù)測靶基因,它們分別為:Eip63E,Pkn,Ptdlns-P2-Ptase。隨即對候選靶基因構(gòu)建熒光素酶報告基因載體,進行體外驗證,結(jié)果表明Ptdlns-P2-Ptase是miR-375-3p真正的靶基因,跟對照組相比,只有Ptdlns-P2-Ptase的熒光素酶活性下降70%左右。最后,為了進一步探討miR-375-3p和其靶基因Ptdlns-P2-Ptase對赤擬谷盜發(fā)育的調(diào)控作用,我們對其靶基因的體內(nèi)功能進行研究。在晚期蛹進行Ptdlns-P2-Ptase RNAi,顯示了與注射miR-375-3p類似物后相似的生物學(xué)表型,盡管Ptdlns-P2-Ptase的敲減對赤擬谷盜變態(tài)發(fā)育的影響更為顯著。這些結(jié)果進一步證明了Ptdlns-P2-Ptase是miR-375-3p的靶基因。與此同時,我們發(fā)現(xiàn)注射miR-375-3p類似物和敲減Ptdlns-P2-Ptase時,蛻皮激素通路上的關(guān)鍵基因Br-c,E74,EcR,E93的表達量與對照組相比沒有顯著差異;與此相對的是,保幼激素通路上的轉(zhuǎn)錄因子Kr-h1的表達量明顯升高。這些結(jié)果表明miR-375-3p和Ptdlns-P2-Ptase都參與調(diào)控赤擬谷盜保幼激素通路,從而影響羽化和生殖。綜上所述,作為赤擬谷盜在晚期蛹低表達,早期成蟲特異高表達的miRNA之一,miR-375-3p調(diào)控蛹的正常發(fā)育,并參與了赤擬谷盜變態(tài)發(fā)育中的羽化和生殖過程,證明了時期特異性miRNAs存在潛在的生物學(xué)意義。此外,miR-375-3p通過其靶基因Ptdlns-P2-Ptase影響雙信使信號通路對保幼激素信號分子的傳遞效率,從而參與調(diào)控赤擬谷盜羽化和生殖過程。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q965
【部分圖文】：

移入培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每天在固定時間觀察表型并拍8h 后各取三只進行總 RNA 提取，用以檢測干擾效率化的成蟲在 5 天后進行雌雄配對，預(yù)交配 3 天后，正化情況，統(tǒng)計結(jié)束后解剖成蟲，觀察生殖腺的發(fā)育情與分析-3p 在赤擬谷盜不同時期表達模式期通過微流體芯片實驗得到 miR-375-3p 在晚期幼蟲、達模式，并用熒光定量 PCR 進一步補充了赤擬谷盜八早期成蟲特異高表達，而在其他時期相對低表達，成蟲暗示 miR-375-3p 在成蟲羽化的過程中發(fā)揮著重要作用蛹順利羽化變成成蟲。第二章 miR-375-3p 對赤擬谷盜羽化和生殖的影響

以加入特異的 miR-375-3p 逆轉(zhuǎn)錄引物得到的 cDNA 作為模板，定量 PCR 檢測 miR-375-3p 的表達量。注射 miR-375-3p mimics 后，定量結(jié)果顯示赤擬谷盜體內(nèi)miR-375-3p 的表達水平明顯上升（圖 2.2A），可以對 miR-375-3p 進行獲得性研究。2.4.2.2 晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 導(dǎo)致羽化缺陷在晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 后，觀察發(fā)現(xiàn)蛹不能成功羽化為成蟲，而且出現(xiàn)了兩種表現(xiàn)，一種是停滯在蛹—成蟲的中間形態(tài)，隨后死亡，此比例占 25%，另一種表型是羽化后翅膀存在缺陷，鞘翅不能合攏，這種比例占到了 35%，還有一部分正常羽化（圖 2.2C-D）。晚期蛹注射 miR-375-3pmimics 改變了蛹期到成蟲期 miR-375-3p 的表達模式，蛹不能正常羽化，由此我們推測 miR-375-3p 在蛹期低表達，成蟲期高表達是使赤擬谷盜羽化階段所必須的。2.4.2.3 晚期蛹注射 miR-375-3p mimics 引起生殖缺陷將羽化成功的成蟲進行雌雄交配，觀察發(fā)現(xiàn)跟野生組或者 NC 對照組相比，成蟲產(chǎn)卵量下降（圖 2.2B），不影響孵化，解剖后發(fā)現(xiàn)生殖腺存在發(fā)育缺陷（圖 2.2E）。這一結(jié)果表明，改變 miR-375-3p 的正常表達模式，將影響赤擬谷盜的生殖。

圖 3.3 miR-375-3p 與候選靶基因在 3’UTR 區(qū)的一個互補位點因雙熒光素酶報告檢測結(jié)果構(gòu)建靶基因的雙熒光素酶報告基因載體進行細胞實驗驗證序列的報告基因載體，與 miR-375-3p mimics 共轉(zhuǎn)染進黑照組，第一組為實驗組：miR-375-3p mimics 、 Pac-pG為對照組：miR-375-3p mimics、Pac-pGL3 空載質(zhì)粒、PRL的活性，每個 miRNA 與靶基因設(shè)置三次技術(shù)重復(fù)，兩次現(xiàn) Tc002125 熒光值明顯下降（圖 3.4C），而 TC002523、現(xiàn)顯著的下調(diào)作用（圖 3.4A-B）。為確定 Tc002125 確定計突變基因 Tc002125-mut，進行雙熒光實驗。設(shè)置實驗組375-3pmimics、Pac-pGL3 重組質(zhì)粒、PRL；實驗組 2：miR-37t 重組質(zhì)粒、PRL；對照組：miR-375-3p mimics、Pac-pGL3測熒光素酶的活性，每個 miRNA 與靶基因設(shè)置三次技術(shù)果如圖 3.4D ，確定了 Tc002125 也就是 Ptdlns-P2-Ptase 基

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本文編號：2819262