背景:對于有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的農(nóng)殘快速檢測,酶抑制法是當(dāng)前國內(nèi)外研究最多的,也是最簡便、靈敏、經(jīng)濟、快速的一種檢測方法。其中乙酰膽堿酯酶(acetylcho 1 inesterase,AChE)的活性受到有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的特異性抑制,故而成為監(jiān)控有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靶酶。本文基于Schulze等人對目前已被研究的乙酰膽堿酯酶酶源進(jìn)行比較分析的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)市面上常見的農(nóng)藥對人和果蠅乙酰膽堿酯酶的雙分子速率常數(shù)較其他酶源要高很多,證明人和果蠅的乙酰膽堿酯酶酶源對農(nóng)藥更敏感,因此本實驗采用人和果蠅來源的乙酰膽堿酯酶作為本實驗研究對象。目前,乙酰膽堿酯酶主要從昆蟲組織或者動物血液中提取,存在產(chǎn)量低、成本高且分離純化困難,最重要是靈敏度差異比較大,因此尋找一種低成本高效的生產(chǎn)系統(tǒng)顯得尤為重要。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般都具有蛋白活性,而且具有高密度發(fā)酵、原料成本低廉、基因遺傳穩(wěn)定性高、表達(dá)效率高等特點,最關(guān)鍵的是可以實現(xiàn)分泌表達(dá)和翻譯后加工修飾,可以滿足工業(yè)化大量生產(chǎn)乙酰膽堿酯酶的需求。目前該系統(tǒng)已經(jīng)得到了大量推廣和應(yīng)用。目的:本實驗利用畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)分別對來自人和果蠅的乙酰膽堿酯酶基因進(jìn)行分泌表達(dá),并初步評估了其對市面上常見8種農(nóng)藥的敏感性大小。初步對這兩個來源的乙酰膽堿酯酶進(jìn)行實驗室水平的探索研究,為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)高敏感性乙酰膽堿酯酶奠定基礎(chǔ)。方法:本文為了實現(xiàn)人和果蠅乙酰膽堿酯酶基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá),根據(jù)Genbank上已發(fā)表的人和果蠅乙酰膽堿酯酶基因的核酸序列分別設(shè)計引物F1/R1和F2/R2,采用高保真PCR和RT-PCR技術(shù)分別擴增出hAChE和dmAChE的開放閱讀框(ORF)片段,選取畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K,利用SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ雙酶切分別將其克隆至載體pPIC9K中構(gòu)建成重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR和雙酶切驗證并測序分析后,經(jīng)Sal Ⅰ酶分別線性化后電穿孔將其轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中。采用MD平板篩選HIS+陽性轉(zhuǎn)化子,并用含有G418抗性梯度的YPD平板進(jìn)行多拷貝菌株篩選,菌落PCR進(jìn)行陽性驗證,最終分別在4.0 mg/mL G418 YPD抗性平板上篩選到人和果蠅AChE 陽性多拷貝酵母表達(dá)菌株,采用通用引物進(jìn)行Mut表型驗證,結(jié)果表明 GS11 5/PPIC9K-hAChE 為 Muts 型,GS115/pPIC9K-dmAChE為Mut+型,對重組酵母菌株分別進(jìn)行0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá),利用Q-sepharose FF柱層析法對發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,獲得了較純的乙酰膽堿酯酶。對發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠圖譜分析,并應(yīng)用改良的Ellman法對發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶活測定和Bradford法進(jìn)行蛋白含量測定。本文還通過初步計算比對GS115/pPIC9K-hAChE和GS115/pPIC9K-dmAChE重組工程菌發(fā)酵上清液對樂果、敵敵畏、甲胺磷、敵百蟲、馬拉硫磷、甲萘威、毒死蜱、克百威的IC50,最終進(jìn)行酶源敏感性效度評估。結(jié)果:GS115/pPIC9K-hAChE在65 kDa處有一條明顯蛋白條帶,大小與預(yù)期hAChE蛋白一致。且hAChE蛋白質(zhì)含量為1.33 mg/mL,含量占總蛋白的5.58%。最高比酶活達(dá)到1080 U/mL。GS115/pPIC9K-dmAChE在67 kDa處有一條明顯蛋白條帶,大小與預(yù)期dmAChE蛋白一致。且dmAChE蛋白質(zhì)含量為2.52mg/mL,含量占總蛋白的10.58%。dmAChE蛋白最高比酶活達(dá)到 1914 U/mL。得出GS115/pPIC9K-hAChE對8種農(nóng)藥IC50結(jié)果如下:敵百蟲敵敵畏克百威馬拉硫磷樂果甲胺磷甲萘威毒死蜱即人乙酰膽堿酯酶對毒死蜱最敏感。得出GS115/pPIC9K-dmAChE對8種農(nóng)藥IC50結(jié)果如下:樂果甲胺磷克百威馬拉硫磷敵敵畏甲萘威敵百蟲毒死蜱。即果蠅乙酰膽堿酯酶對毒死蜱最敏感。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q55
【部分圖文】：

３．１．４重組酵母ＧＳ１１５／ｐＰＩＣ９Ｋ－／ｄＣ７，Ｅ的菌落ＰＣＲ鑒定逡逑從４．０ｍｇ／ｍＬＹＰＤＧ４１８平板上挑取多拷貝單克隆，以特異性引物ＦＩ和Ｒ１進(jìn)逡逑行菌落ＰＣＲ鑒定，擴增出一條１．８邋ｋｂ大小的條帶（圖４），大小與預(yù)期相符。表明逡逑ｐＰＩＣ９Ｋ－／＾Ｃ／；￡已經(jīng)整合到酵母染色體上。逡逑２８逡逑

連續(xù)測定３邋ｍｉｎ。以１６化對應(yīng)農(nóng)藥反應(yīng)液和６４邋ｇＬ磷酸鈉緩沖液加２０邋ｕＬｌ．２５邋ｍＭ逡逑Ｅｌｌｍａｎ試劑作為每次測定的空白對照。以磷酸緩沖液代替農(nóng)藥反應(yīng)液作為無農(nóng)藥逡逑抑制酶活對照。計算k沃峙┮┑拿富鉅種坡始懊恐峙┮┑模桑茫擔(dān)啊Ｈ繽跡桿荊藻義希鋼殖＜┮瑁粒茫瑁琶敢種坡始撲�，并粙咂瓤z掄巰咄跡貿(mào)觶鋼峙┮┒裕瑁粒茫瑁佩義系模桑茫擔(dān)埃嚀迨菁鉸跡場ｅ義希掊澹保玻啊稿義希煞﹀義希懾危灣危歟希希椋耄掊義

本文編號：2817187