硫酸轉(zhuǎn)移酶(Sulphotransferase,SOTs)是一類在動(dòng)植物及微生物中高度保守的蛋白家族,催化磺基(SO_3~-)轉(zhuǎn)移至含氨基或羥基的底物,在細(xì)胞內(nèi)具有重要的生理學(xué)功能。目前,SOTs一般通過原核表達(dá)并利用親和層析法純化,采用同位素法、吸光值法等測定酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù),結(jié)合體外酶活測定結(jié)果與生理數(shù)據(jù)分析其在生物體內(nèi)的具體生物學(xué)功能。但該體系存在著一些不足和待解決的問題,如:純化蛋白濃度低且純度不高、PAPS作為通用底物昂貴且易分解、酶學(xué)測定操作復(fù)雜和耗時(shí)等。本研究初步探討了解決這些問題的方法。利用已知基因AtSOT12(At2g03760)在Oryza sativa Indica Group基因庫中同源比對,得到同源性最高的OsSOT,通過與報(bào)道的序列比對表明其為OsSOT1。依據(jù)最新命名法,可將OsSOT1與AtSOT12歸為一個(gè)家族,暗示兩者在結(jié)構(gòu)與功能上的相似性。目前已報(bào)道了一部分?jǐn)M南芥及人SOTs的酶學(xué)信息,但對水稻SOTs分析只停留在基因和生理學(xué)信息上。由此開展以下方面的工作。探索不同標(biāo)簽及表達(dá)條件解決AtSOT12及OsSOT1表達(dá)過程中易形成包涵體的問題,結(jié)果表明,在LB培養(yǎng)基中增加NaCl濃度至0.2-0.4 M,可降低包涵體的形成;采用MBP作為融合標(biāo)簽可顯著增加融合蛋白的可溶性,但不利于標(biāo)簽的去除;采用6His及GST雙標(biāo)簽可純化出較高純度的蛋白樣品。采用多酶反應(yīng)體系合成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS),并探討了最佳合成條件。結(jié)果表明,最適合成條件為pH 8-8.5,溫度35℃,加入PK及PEP可增加PAPS的合成率(90%);利用強(qiáng)陰離子交換柱純化分離PAPS的結(jié)果表明,選擇KCl溶液(pH 4.5)進(jìn)行梯度洗脫(200-500 mM)可純化得到高濃度、高純度PAPS,但在純化過程中可能有PAPS的降解。依據(jù)3’,5’-二磷酸核苷酸酶(Hal2)突變體G236V對PAP親和力為PAPS的5592倍這一特性,建立了由G236V/肌激酶/丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶(G236V/MK/PK/LDH)構(gòu)成的硫酸轉(zhuǎn)移酶偶聯(lián)酶檢測體系。利用該體系測定了AtSOT12催化不同底物的活性,與相關(guān)報(bào)道結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),所測K_m值相近但kcat較大,可能因?yàn)槿軇┮掖紝λⅢw系的影響,也可能是本次反應(yīng)體系加入了甘油(由于底物為脂溶性,加入甘油可能促進(jìn)了反應(yīng)),加入了足量的PAPS,蛋白純度高等。利用該體系探索OsSOT1的一些底物,結(jié)果表明,OsSOT1能催化某些植物激素,如水楊酸(K_m=360.94μM)、24-表油菜素內(nèi)酯(K_m=5.83μM),也能催化5-羥基吲哚乙酸、孕烯醇酮及去氫表雄酮等。綜上述,本課題初步系統(tǒng)的構(gòu)建了檢測硫酸轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)信息體系,并測定了未報(bào)道的OsSOT1的一些底物酶學(xué)信息,建立了高通量、便捷、安全的SOTs活性檢測體系,對水稻及其他特定硫酸轉(zhuǎn)移酶的研究有一定基礎(chǔ)性意義。
【學(xué)位單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q946.5
【部分圖文】：

化反應(yīng)示意圖。ST 為 SOTs，催化紅色磺酸基團(tuán)到子；X=O 時(shí)，稱 SOT 為 O-SOT；X=NH/NR 時(shí)，水稻及擬南芥等都鑒定出了許多 SULTs（表T9 基因被鑒定及表征[4]。在動(dòng)物中，細(xì)胞質(zhì)

1 與黑芥子苷（洋紅色棒狀）和 PAP（青色棒狀）結(jié)合的區(qū)域 I：藍(lán)色;區(qū)域 II：黃色;區(qū)域 III：品紅色：區(qū)域 IV區(qū)域（黑色），催化殘基（紅色）和脯氨酸 136（橙色）Ts 氨基酸比對表明，有四個(gè)保守區(qū)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、合，Ⅰ區(qū)域靠近末端（N 端）結(jié)合 5’-磷酰硫酸；Ⅱ Lys59，接受反應(yīng)過程中的質(zhì)子，在其 C 端的 A[27; 28]。每個(gè)酶的底物結(jié)合部位在結(jié)構(gòu)上有所差別物的結(jié)合。在許多植物 SOTs 中，在區(qū)域Ⅲ和Ⅳ聚 Glu（圖 1.3）。盡管動(dòng)植物在重要的結(jié)構(gòu)區(qū)異性，如在所有人的 SOTs 中都存在保守序列 K在[26]。此外，細(xì)胞質(zhì) SOTs 與細(xì)胞膜 SOTs 在底胞膜 SOTs 底物結(jié)合位點(diǎn)一般是一個(gè)大的開放裂子的 5’-磷酸，而胞質(zhì) SOTs 底物結(jié)合位點(diǎn)是較深的

圖 4.4 SOT 基因構(gòu)入 pHND 示意圖電泳結(jié)果表明，經(jīng)常規(guī)誘導(dǎo)，Hal2 標(biāo)簽表達(dá) SOT 融合蛋白時(shí)，有蛋白在破碎沉淀中（圖 4.5A/B 中條帶 3），在洗脫液中目的蛋白含量少A/B 中條帶 9 箭頭指示），無法進(jìn)行切除標(biāo)簽。A B圖 4.5 Hal2 標(biāo)簽純化 Hal2-AtSOT12(A)和 Hal2-OsSOT(B)蛋白電泳圖。（M. 蛋白1. 誘導(dǎo)前，2. 誘導(dǎo)后，3. 離心沉淀，4. 離心上清，5.上樣，6. 裂解液洗滌，7. 8. 洗滌，9. 蛋白洗脫）

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1 周宏飛;水稻硫酸轉(zhuǎn)移酶（OsSOT1）的原核表達(dá)、純化與酶活測定[D];浙江師范大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2814618