發(fā)布時(shí)間：2020-08-28 10:53

　　 作為1,3-間苯二酚苯環(huán)5位被長(zhǎng)鏈烷基取代的一類酚類類脂,烷基間苯二酚(Alkylresorcinols,ARs)是谷物皮層的重要活性成分和標(biāo)記物,也是糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(LS/T3244—2015)評(píng)判全麥粉的重要生物標(biāo)記物。ARs具有抗氧化、抗寄生蟲、抗腫瘤、抑菌、降糖降脂等生理活性。目前,大部分的ARs是通過從植物中提取而來,而植物中存在ARs含量低并不能滿足市場(chǎng)的需求,本文通過生物合成方法來大量生產(chǎn)ARs。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一種代謝背景清晰、基因組已知的真核模式生物,具有良好的耐酸性、遺傳操作簡(jiǎn)便、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。本文以釀酒酵母作為表達(dá)宿主,將優(yōu)化后的黑麥(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor)ARSs基因與pRS42H載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,并使用LiAc/PEG化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母,構(gòu)建產(chǎn)ARs的重組釀酒工程菌株SN001、SN002和SN003,重組菌株在30℃、YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),SN001、SN002和SN003重組酵母ARs產(chǎn)量分別是44.5±3.1μg/mL、23.5±2.3μg/mL、28.3±2.9μg/mL。乙酰輔酶A是生物體內(nèi)重要的活性中間體,為了研究其對(duì)酵母中ARs合成與積累的影響,分別在酵母中敲除消耗乙酰輔酶A的支路的基因,并過表達(dá)合成乙酰輔酶A的基因。文本敲除MLS1(Malate synthase,MLS1)和CIT2(Citrate synthase,CIT2)基因,考察各突變菌株ARs的合成能力,發(fā)現(xiàn)MLS1和CIT2基因單獨(dú)缺失有利于提高重組酵母菌株對(duì)ARs的合成與積累。MLS1基因缺失使SN009、SN011和SN013菌株的ARs最高產(chǎn)量分別為60.9±2.2μg/mL、54.6±3.7μg/mL和50.5±4.3μg/mL,較重組酵母菌株提高了0.4倍、1.3倍、0.65倍�！鰿IT2基因缺失使SN010、SN012和SN014菌株的ARs最高產(chǎn)量分別是58.7±3.2μg/mL、50.3±2.6μg/mL和63.1±2.1μg/mL,較重組酵母菌株提高了0.56倍、1.19倍、1.22倍。為了進(jìn)一步提高ARs產(chǎn)量,同時(shí)在釀酒酵母中敲除MLS1和CIT2基因,使SN016、SN017和SN018菌株產(chǎn)量分別達(dá)到75.4±1.8μg/mL、60.9±1.2μg/mL和68.6±2.6μg/mL,較重組酵母分別提高了0.7倍、1.67倍,1.41倍。以釀酒酵母基因組為模板,分別擴(kuò)增ACS1(Acetyl-CoA synthetase,ACS1)和DGA1(DiacylGlycerol Acyltransferase,DGA1)基因,將改造后的釀酒酵母表達(dá)載體pESC-trp與ACS1和DGA1基因以及目的基因連接構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒,然后將過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母后構(gòu)建過表達(dá)酵母菌株。研究表明SN020、SN022和SN024菌株產(chǎn)量分別是72.6±3.3μg/mL、51.6±3.2μg/mL、59.3±3.5μg/mL,較重組酵母菌株分別增加了0.6倍、1.2倍、1.1倍。SN021、SN023和SN025菌株產(chǎn)量分別達(dá)到54.6±2.9μg/mL、32.8±2.5μg/mL、39.6±3.1μg/mL,較重組酵母菌株提高了0.2倍、0.4倍、0.4倍。本文主要以優(yōu)化后的黑麥和高粱的ARSs(Alkylresorcinol synthase,ARSs)基因基礎(chǔ),構(gòu)建產(chǎn)ARSs釀酒酵母工程菌株,研究了不同工程菌生物合成烷基間苯二酚的能力,并進(jìn)行了初步的代謝改造,為生物合成法制備ARs研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;TS261.11

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