【摘要】：蛋白酶(protease)是生物體內(nèi)通過切斷肽鍵從而水解蛋白質(zhì)的一類酶的總稱,控制著蛋白質(zhì)的大小、組成、空間構(gòu)象及其最終降解。生物體內(nèi)的生理活動和疾病的發(fā)生與蛋白酶息息相關(guān)。沙雷氏蛋白酶屬于鋅金屬蛋白酶M10B亞家族,其中某些種類是一些疾病的關(guān)鍵致病因子。專一性沙雷氏蛋白酶抑制劑在體外可靶向抑制沙雷氏蛋白酶。通過沙雷氏蛋白酶抑制劑抑制沙雷氏蛋白酶,從而減弱產(chǎn)沙雷氏蛋白酶的細菌病原體的活性,成為疾病治療的新思路。本文所研究的沙雷氏蛋白酶MP和其抑制劑LupI均來源于海洋微生物Flavobacterium sp.YS-80-122,本文對該蛋白酶MP進行了原核表達,并且分別純化了蛋白酶MP、抑制劑LupI和MP-LupI的復(fù)合物,進行結(jié)晶條件篩選和結(jié)構(gòu)功能解析,研究結(jié)果分述如下:蛋白酶MP原核表達載體的構(gòu)建:以全基因組DNA作為模板,用設(shè)計的帶有酶切位點的引物進行PCR擴增。先構(gòu)建pTOPO-MP原核克隆質(zhì)粒,再用表達質(zhì)粒pET22b和pTOPO-MP構(gòu)建pET22b-MP原核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α培養(yǎng)。將重組子用原始引物擴增并基因測序篩選陽性重組子,表達片段約為1443 bp,與預(yù)期的MP條帶大小一致。將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21誘導(dǎo)及表達。菌液重懸破碎后的上清用SDS-PAGE凝膠電泳和酪蛋白平板檢測驗證。結(jié)果表明該蛋白的大小約48 kDa,與蛋白酶MP分子質(zhì)量相同,同時具有蛋白酶活性,符合原始蛋白酶MP特征。MP-LupI的復(fù)合物的制備及純化:用HisTrap HP色譜柱對蛋白酶MP進行純化,再用HiLoad~TMM 26/600 Superdex 200 prep grade凝膠柱和HiPrep~(TM) Q-FF16/10柱對抑制劑LupI進行純化,均達到電泳純后,兩者以等摩爾比混合,得到MP-LupI復(fù)合物,最后用HiLoad~(TM) 26/600 Superdex 200 prep grade凝膠柱對MP-LupI復(fù)合物進行純化,可達到電泳純,單次純化獲得約95μL蛋白含量為20 mg/mL的MP-LupI復(fù)合物樣液。MP-LupI復(fù)合物的結(jié)晶條件篩選:采用懸滴蒸發(fā)擴散方法對游離LupI和MP-LupI復(fù)合物進行結(jié)晶條件篩選。LupI采用初篩的22種條件進行復(fù)篩。MP-LupI復(fù)合物在蛋白酶MP和抑制劑LupI結(jié)晶條件的基礎(chǔ)上,對結(jié)晶溶液濃度、沉淀劑和pH做調(diào)整,結(jié)合商業(yè)結(jié)晶試劑盒在24孔板上做結(jié)晶條件初篩。LupI在0.1 M NaCl,0.1 M BIS-TRIS pH 6.5,1.5 M(NH_4)_2SO_4條件下得到晶體。MP-LupI復(fù)合物在兩種條件下均獲得晶體:0.1 M DL-Malic acid,pH 7.0,12%w/v PEG 3350條件,得到MP-LupI復(fù)合物的菱形晶體;0.2 M NaCl,0.1 M MES,pH6.5,10%w/v PEG 4000條件,得到MP-LupI復(fù)合物的棱形晶體。晶體的X-射線衍射結(jié)果及精修:對復(fù)篩成功的LupI晶體和本實驗篩選出的MP-LupI復(fù)合物晶體進行X-射線衍射。在上海光源進行LupI晶體X-射線衍射數(shù)據(jù)收集,分辨率達1.59?,其晶胞空間為P 21 21 21,晶胞參數(shù)為a=34.04?、b=39.28?、c=62.57?、α=β=γ=90°,使用分子置換法精修至R_(work)為0.210、R_(free)為0.218;MP-LupI復(fù)合物晶體以同樣方法得到了分辨率為2?的高質(zhì)量衍射數(shù)據(jù),其晶胞空間為P 1 21 1,晶胞參數(shù)為a=51.66?、b=51.85?、c=102.14?、α=γ=90°、β=97.68°,精修至R_(work)為0.184、R_(free)為0.230。LupI和MP-LupI復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)分析:由三維結(jié)構(gòu)圖可知,抑制劑LupI形成一個緊湊的七股反平行β-桶,具有簡單的上下拓撲結(jié)構(gòu),通過N-末端的長鏈結(jié)構(gòu)插入MP的活性口袋直達活性中心,改變了鋅離子活性中心的構(gòu)象達到抑制效果。與同源抑制劑對比LupI缺少一條β-折疊,但其α-螺旋的延長替代了部分結(jié)構(gòu)上的作用,使抑制劑結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。通過MP-LupI復(fù)合物與蛋白酶及抑制劑的對比,可以明確抑制發(fā)生過程中重點改變的部位是鋅離子活性中心及兩者接觸部位的loop環(huán)。抑制劑的N-末端和MP的鋅離子中心發(fā)生鍵合,使控制酶活的Tyr226偏轉(zhuǎn),占據(jù)了蛋白酶與底物結(jié)合的位置從而達到了抑制作用。抑制劑的β-折疊3和4之間的loop環(huán)也與MP形成氫鍵,使抑制效果更為穩(wěn)定。本文通過對MP-LupI復(fù)合物晶體的X-射線衍射,獲得了MP-LupI復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu),分析了蛋白酶與抑制劑結(jié)合前后在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別,并與同源抑制劑進行了比較。有助于從結(jié)構(gòu)上深入理解沙雷氏蛋白酶與抑制劑之間的相互作用機制,確定抑制過程中的關(guān)鍵區(qū)域,為將來設(shè)計專一性蛋白酶抑制劑藥物提供參考。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

質(zhì)結(jié)晶研究質(zhì)生長原理及影響因素是相變現(xiàn)象，在液相或者氣相中達到過飽和狀態(tài)而析出晶核，構(gòu)成形成晶體，分為晶核形成和晶體生長兩個過程[55]。對蛋白質(zhì)溶液的要求很高，蛋白含量在 10 mg/mL 以上，純度至少此之外，沉淀劑、添加劑、pH 值，溫度、壓力、外加物理場及其響蛋白的結(jié)晶[56, 57]。Majeed[58]發(fā)現(xiàn)沉淀劑的使用可以促進生物大有序聚集，使蛋白結(jié)晶的篩選成功率提高 3.5 倍并可顯著優(yōu)化晶體有機沉淀劑和 PEG 三種沉淀劑在結(jié)晶過程中，會導(dǎo)致不同的分子也許就是沉淀劑能誘導(dǎo)蛋白結(jié)晶的原因[59]。質(zhì)結(jié)晶方法白質(zhì)結(jié)晶相圖 1-1 中，橫坐標(biāo)表示的是沉淀劑濃度，A-D 是四種常，分別是微批量法(Microbatch)、蒸發(fā)擴散法(Vapor diffusion)、透)和自由界面擴散法(Free-interface diffusion)[60]。

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文逡逡1.6 蛋白質(zhì)晶體構(gòu)象研究1.6.1 晶體數(shù)據(jù)收集X-射線的波長范圍約在 0.1-10 nm，晶體中原子的間隔也屬于這一數(shù)量級[64]。因此，在 X-射線的衍射下，晶體中的原子會被激發(fā)出反射波，反射波可互相疊加而產(chǎn)生次生衍射，攜帶物體信息，形成一張復(fù)雜的衍射圖案[65]（如圖 1-2 所示）。X-射線的衍射不能直接檢測出單個分子的結(jié)構(gòu)，須盡可能從所有角度對晶體發(fā)射X-射線光束，收集完整的衍射圖案，才能得到相對準(zhǔn)確的蛋白三維結(jié)構(gòu)。

擴增結(jié)果 M：Trans2K Plus DNA Ma result of MP length gene. M：Trans2K amplificated result of MP表達載體的構(gòu)建重組質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳，有結(jié)果經(jīng) NCBI 數(shù)據(jù)庫 BLAST 驗證重組質(zhì)粒，構(gòu)建路線圖見圖 2-2。Ndel XhoIPCR 擴增的 MP 基因NdelAmpp（5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李亮;;蛋白酶活性受體與支氣管哮喘[J];醫(yī)學(xué)綜述;2006年01期

2 李艷青,孔保華,王濤;鰱魚組織蛋白酶活性影響因素的研究[J];食品科技;2004年09期

3 曾蔚,賈文祥,冉玉平,鄺玉,熊琳,張再蓉,馬巨輝;糠秕馬拉色菌蛋白酶活性的研究[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;2004年09期

4 曾凱芳,李洪軍,明建;保鮮鴨肉蛋白酶活性變化及其影響因素研究[J];肉類工業(yè);2003年03期

5 ;老年癡呆緣于腦部的一種蛋白酶活性過大[J];醫(yī)學(xué)情報工作;2003年03期

6 覃舒文,史軼蘩,鄧潔英;血清胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3蛋白酶活性檢測的初步臨床意義[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2001年03期

7 孔保華,南慶賢;鰱魚組織蛋白酶活性的研究[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2001年02期

8 王建飛,Dayid Sarment,Edward T．Lally,Paul Billings,Harry Rozmiarek;犬口腔病變組織內(nèi)的蛋白酶活性[J];上海實驗動物科學(xué);1998年Z1期

9 白東清,喬秀亭,魏東,王茜;不同生長階段鯉蛋白酶活性的初步研究[J];天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報;1999年03期

10 ;抗生素[J];生物技術(shù)通報;1987年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張雅;夏雷;伍瀟怡;劉永章;呂斌;;川芎嗪抑制Lon蛋白酶活性的機制研究[A];第八屆全國醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)第五屆全國臨床應(yīng)用生物化學(xué)與分子生物學(xué)2013華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2013年

2 付合廷;戴政;唐曉峰;唐兵;;Pyrolysin的N端前肽及C端延伸區(qū)對其蛋白酶活性的影響[A];第二屆中國青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

3 付合廷;戴政;唐曉峰;唐兵;;Pyrolysin的N端前肽及C端延伸區(qū)對其蛋白酶活性的影響[A];2006中國微生物學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

4 許傲天;周艷君;李國新;于海;閆麗萍;童光志;;PRRSV Nsp4蛋白酶活性分析及活性中心的鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

5 韓佩君;尹文;;HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶活性測定方法研究進展[A];中華醫(yī)學(xué)會全國新發(fā)和再發(fā)傳染病2012年學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2012年

6 劉培培;溫韻潔;賓金華;;花生胰蛋白酶抑制劑(PI)基因的克隆和原核表達[A];第六屆中國植物逆境生理學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2010年

7 邊慧慧;黃P";王秀華;蔣繼志;;牙鲆幼魚消化道內(nèi)蛋白酶活性及食糜蛋白的GFP示蹤[A];新型疫苗研發(fā)及基因工程疫苗應(yīng)用研討會論文集[C];2010年

8 張偉;陳立僑;顧志敏;賈永義;;池養(yǎng)和野生條件下翹嘴紅湆消化酶活性比較的初步研究[A];2008年上海市動物學(xué)會學(xué)術(shù)會議論文集（一）[C];2008年

9 何偉;岳生峗;王帥;才學(xué)鵬;;Ddi1樣蛋白在豬帶絳蟲上蛋白酶活性研究[A];中國動物學(xué)會寄生蟲學(xué)專業(yè)委員會第十屆全國寄生蟲學(xué)青年工作者學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2016年

10 李紅勝;謝為天;徐春厚;;一株解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究[A];生態(tài)環(huán)境與畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展學(xué)術(shù)研討會暨中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2012年學(xué)術(shù)年會和第七屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會會議論文集——T06飼料衛(wèi)生與安全專題[C];2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 齊恩鳳;基于底物序列的蛋白酶的特異性研究[D];山東大學(xué);2018年

2 杜曼婷;蛋白質(zhì)磷酸化介導(dǎo)的μ-鈣蛋白酶活性變化機理[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

3 胡巍;丙型肝炎病毒NS3蛋白酶及抑制肽研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

4 李安娜;嗜熱毛殼菌熱穩(wěn)定蛋白酶的純化、基因克隆與表達[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

5 郝薇;TMR發(fā)酵過程中微生物及其蛋白酶對蛋白降解的作用機理研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 米海峰;不同蛋白源和大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子對牙鲆蛋白消化酶的活性與基因表達的影響[D];中國海洋大學(xué);2008年

7 毛紅霞;丙型肝炎病毒不同基因亞型NS3蛋白酶比較及相關(guān)細胞蛋白的篩選[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

8 黃峰;大口鲇化學(xué)性消化機能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

9 曾雪峰;淡水魚發(fā)酵對酸魚品質(zhì)影響的研究[D];江南大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 苗娟;基于寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶活性的抗病毒抑制劑篩選[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

2 楊玉龍;基于家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)制備重組人蛋白酶3的研究[D];江蘇大學(xué);2019年

3 張琳桓;沙雷氏蛋白酶MP與其抑制劑LupI結(jié)構(gòu)功能研究[D];上海海洋大學(xué);2019年

4 劉子卿;鉤絲孢屬真菌的形態(tài)特征及其高產(chǎn)蛋白酶菌株培養(yǎng)優(yōu)化[D];南華大學(xué);2019年

5 唐榆;基于綠色熒光蛋白的蛋白酶活性檢測與核酸運輸新方法[D];湖南大學(xué);2018年

6 郭晶晶;基于表面活性劑調(diào)控菠蘿蛋白酶活性的研究[D];揚州大學(xué);2018年

7 余貴香;飼糧添加蛋白酶對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、回腸氨基酸消化率和腸道健康的影響[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 高俊;重組人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶的表達與純化[D];北京化工大學(xué);2017年

9 邢暢;檸檬酸釋放方式與SiO_2納米粒對腸道蛋白酶活性影響的體外研究[D];天津大學(xué);2017年

10 譚宇聲;CRCoV主蛋白酶與抑制劑復(fù)合物晶體學(xué)初步研究及活性測定[D];天津大學(xué);2017年

本文編號：2791049