【摘要】：N-3多不飽和脂肪酸(N-3 PUFA)在糖、脂與蛋白代謝中發(fā)揮重要作用,具有緩解胰島素抵抗、抗炎癥和保護(hù)心血管等作用。為研究N-3 PUFA在肌肉組織與肌細(xì)胞能量代謝中可能的作用機(jī)制,本試驗(yàn)以fad3轉(zhuǎn)基因小鼠為材料,分析其肌肉、肝臟與脂肪組織中N-3PUFA組成變化;利用fad3轉(zhuǎn)基因肌衛(wèi)星細(xì)胞與添加外源DHA的對(duì)照組肌衛(wèi)星細(xì)胞,分析N-3 PUFA對(duì)三羧酸循環(huán)(TCA)關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶基因表達(dá)的影響及對(duì)PPARs基因和蛋白表達(dá)的影響;利用PPAR-α激活劑或抑制劑研究對(duì)PPARs基因和蛋白表達(dá)及對(duì)TCA關(guān)鍵限速酶基因的影響;通過(guò)蛋白質(zhì)譜、CHIP-seq等研究手段分析N-3 PUFA的作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:(1)轉(zhuǎn)基因小鼠的fad3基因呈組織特異性表達(dá),肝臟和肌肉組織中顯著表達(dá),尤其降低了肌肉與肝臟中的短鏈與中鏈脂肪酸總量;fad3誘使N-3 PUFA含量增加,N-6 PUFA含量下降,促進(jìn)N-6 PUFA轉(zhuǎn)化為N-3 PUFA;(2)在fad3小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞中,N-3 PUFA水平明顯提升;(3)蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示,fad3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和添加100ng/ml DHA的對(duì)照組細(xì)胞中的脂肪酸代謝能力增強(qiáng),線粒體氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)(TCA)相關(guān)蛋白表達(dá)明顯降低;(4)定量PCR結(jié)果表明,N-3 PUFA的增加使TCA相關(guān)基因如Idh2、Ogdh、Sdha和Mdh2的表達(dá)顯著降低;(5)蛋白質(zhì)譜發(fā)現(xiàn),N-3 PUFA影響了PPAR蛋白通路,PPAR-α基因在fad3肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高,而PPAR-β和PPAR-γ無(wú)明顯變化;PPAR-α蛋白在fad3細(xì)胞或DHA的肌衛(wèi)星細(xì)胞的表達(dá)顯著降低,尤其是細(xì)胞核中的表達(dá)量明顯減少,而PPAR-β和PPAR-γ無(wú)明顯變化;(6)添加PPAR-α抑制劑MK886,抑制了PPAR-α表達(dá),降低了TCA關(guān)鍵限速酶基因如Idh2、Ogdh、Sdha和Mdha2的表達(dá);PPAR-α激活劑WY14643,提高PPAR-α蛋白表達(dá),促進(jìn)TCA關(guān)鍵限速酶表達(dá)的增加;(7)CHIP-seq結(jié)果表明,胞質(zhì)內(nèi)增多的N-3 PUFA會(huì)抑制PAPR-α與線粒體能量代謝相關(guān)基因的DNA序列的結(jié)合。上述結(jié)果表明,fad3催化體內(nèi)N-6 PUFA轉(zhuǎn)化為N-3 PUFA,顯著提高體內(nèi)N-3 PUFA含量,胞質(zhì)內(nèi)增多的N-3 PUFA抑制了PPAR-α與細(xì)胞線粒體能量代謝相關(guān)基因的DNA序列的結(jié)合,影響肌衛(wèi)星細(xì)胞線粒體能量代謝。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q952
【圖文】：

PPAR-α 調(diào)控 FAD3 小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞能量代謝機(jī)制研究3. 結(jié)果fad3 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定 DNA 鑒定鑒定結(jié)果如圖 3.1 所示，PCR 產(chǎn)物條帶較暗或者無(wú)條帶的小鼠視為轉(zhuǎn)基。連續(xù)繁殖 4 個(gè)月后，共得到后代 86 只，雄鼠 48 只，雌鼠 38 只；f陽(yáng)性鼠有 61 只，其中雄鼠 33 只，雌鼠 28 只，雄雌約比為 1:1。結(jié)果 基因的轉(zhuǎn)入沒(méi)有對(duì)小鼠的生殖情況產(chǎn)生阻礙，小鼠均可以正常生育；后雄比為 1:1，說(shuō)明 fad3 基因沒(méi)有對(duì)小鼠性別產(chǎn)生控制。

圖 3.2 轉(zhuǎn)基因小鼠 Fad3 基因表達(dá)量檢測(cè)Fig 3.2 The Real-Time PCR identification of Fad3 m基因小鼠的肝臟組織、肌肉組織和脂肪組織進(jìn)行脂對(duì)三種組織的脂肪酸組成和比例的影響。中短鏈脂肪，fad3 小鼠肌肉組織中丁酸、己酸和辛酸含量都得到酸和十一酸含量下降；肝臟中不僅丁酸、己酸和辛酸月桂酸含量都呈下降趨勢(shì)；脂肪組織中，丁酸與己酸含量下降結(jié)果；從脂肪酸總量看，轉(zhuǎn)基因鼠的肌肉、肪酸均下降（表3.1）。短鏈脂肪酸含量的總體減少，驗(yàn)酸氧化分解，對(duì)脂肪酸的合成有抑制作用，減少生物表 3.1 肌肉、肝臟和脂肪中、短鏈脂肪酸分析.1 Analysis of short- and medium-chain fatty acids in m

內(nèi)蒙古大學(xué) 碩士學(xué)位論文促進(jìn) N-6 PUFA 轉(zhuǎn)化為 N-3 PUFA，并且提高了體內(nèi)脂肪的利用率。由于肌肉是能量代謝與消耗中心，以肌肉衛(wèi)星細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，可以在體外研究 N-3 PUFA 對(duì)細(xì)胞 TCA 循環(huán)影響的影響機(jī)制。3.2 小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞的原代培養(yǎng)3.2.1 細(xì)胞形態(tài)自轉(zhuǎn)基因鼠和野生型鼠肌肉分離肌肉衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞呈放射性排列增殖。肌肉衛(wèi)星細(xì)胞為扁平股狀，呈梭形或紡錘形，少數(shù)為多角形（圖 3.3）。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)培養(yǎng)基面積 80%左右時(shí)，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

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本文編號(hào)：2790707