【摘要】：Penifulvin A是由灰黃青霉菌(Penicillium griseofulvum NRRL 35584)產(chǎn)生的具有獨特結(jié)構(gòu)的倍半萜類天然產(chǎn)物,其擁有五個立體手性中心,結(jié)構(gòu)中的四個稠環(huán)共用中心的季碳原子,形成一個罕見的二氧-[5.5.5.6]-窗烷結(jié)構(gòu),且其中的兩個γ-內(nèi)酯環(huán)和δ-內(nèi)酯環(huán)共享一個手性縮醛中心。生物活性研究顯示,penifulvin A具有高效專一的草地貪夜蛾的幼蟲(農(nóng)作物主要害蟲之一,尤其是玉米)殺蟲活性,被評價為最具開發(fā)價值的創(chuàng)新型生物農(nóng)藥之一。鑒于其新穎獨特的化學結(jié)構(gòu)以及良好的生物活性,penifulvin A引起了化學家和生物學家廣泛關(guān)注,目前化學家已借助逆合成分析和間位-光環(huán)加成反應實現(xiàn)了penifulvin A的化學全合成,但在立體選擇性構(gòu)建二氧-[5.5.5.6]-窗烷骨架時仍存在一定難度。相對于化學全合成,penifulvin A的生物合成機制卻一直未見報道。因此,penifulvin A生物合成途徑的研究,有望指導化學仿生合成,同時其特殊的化學結(jié)構(gòu)也必然蘊藏著獨特的酶學合成機制�；诖四繕�,本課題從P.griseofulvum NRRL 35584中鑒定了penifulvin A生物合成基因簇(peni),通過生物信息學分析、體內(nèi)基因敲除、化合物喂養(yǎng)、體外生物酶催化以及異源生物合成的方法與手段,系統(tǒng)闡明了penifulvin A的生物合成機制,由此深刻解析了自然界中獨特窗烷骨架結(jié)構(gòu)的生物合成過程,為后續(xù)通過組合生物合成技術(shù)對不同窗烷類型天然產(chǎn)物進行改造,從而獲得結(jié)構(gòu)更加新穎、殺蟲活性更強的衍生物,奠定了堅實的理論和物質(zhì)基礎。本研究完成工作如下:(1)Penifulvin A的發(fā)酵條件及其檢測分離方法的確定。外界環(huán)境因素是影響微生物代謝譜變化的重要原因,為了確定研究penifulvin A生物合成的物質(zhì)基礎,首先確定了P.griseofulvum NRRL 35584在實驗室培養(yǎng)條件下生產(chǎn)penifulvin A的條件。小量發(fā)酵實驗顯示,P.griseofulvum NRRL35584在25℃,大米培養(yǎng)基上發(fā)酵七天的條件下,能夠穩(wěn)定生產(chǎn)penifulvin A,并通過后續(xù)的分離和結(jié)構(gòu)鑒定進行驗證。Penifulvin A生產(chǎn)及其檢測分離條件的確定,為后續(xù)各突變株培養(yǎng)條件和中間體的檢測與分離奠定了良好的工作基礎。(2)Penifulvin A生物合成基因簇(peni)的鑒定。通過真菌次級代謝基因簇分析網(wǎng)站(anti-SMASH fungal version)預測發(fā)現(xiàn),P.griseofulvum NRRL 35584的全基因組中含有六個萜類次級代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的基因簇。利用結(jié)構(gòu)導向的萜類環(huán)化酶系統(tǒng)進化樹分析策略,scaffold 14中的萜類生物合成基因簇(peni)被認為與penifulvin A的產(chǎn)生可能有關(guān)。生物信息學分析表明,peni基因簇中共含有六個基因,除了倍半萜環(huán)化酶基因(peniA)外,還有細胞色素P450單氧化酶基因(peniB),核黃素依賴的單氧化酶基因(peniC),兩個雙氧化酶基因(peniD和peniF)以及一個未知功能蛋白基因(peniE)。RT-PCR結(jié)果顯示,peni基因簇的轉(zhuǎn)錄與penifulvin A的產(chǎn)生成對應關(guān)系。倍半萜環(huán)化酶基因(peniA)的進一步敲除結(jié)果顯示,基因peniA敲除突變株完全喪失了penifulvinA的生產(chǎn)能力,由此清晰地明確了peni基因簇與penifulvinA生產(chǎn)的相關(guān)性。peni基因簇的確定,是闡明penifulvin A生物合成機理的重要前提。(3)Penifulvin A生物合成相關(guān)基因的確定。peniB~peniF五個基因的逐個敲除以及peniD~peniF三個基因同時敲除的結(jié)果顯示,peniB或peniC的單基因缺失,P.griseofulvum NRRL 35584均會喪失penifulvin A的生產(chǎn)能力。但是,peniD~peniF三個基因的單獨缺失或同時缺失,均不會影響penifulvin A的產(chǎn)生。該結(jié)果表明,peni基因簇中僅peniA~peniC三個基因可能與penifulvin A的生物合成相關(guān)。進一步的研究顯示,通過在異源宿主A.nidulans A1145中共表達peniA~peniC三個基因,penifulvin A能夠高效產(chǎn)生,證明penifulvin A的生物合成確實僅需要peniA、peniB和peniC三個基因參與。通過基因敲除及其異源宿主生產(chǎn)結(jié)果揭示了自然界中獨特二氧-[5.5.5.6]-窗烷雜環(huán)的構(gòu)建過程僅需三個基因參與。(4)倍半萜環(huán)化酶PeniA催化功能的研究。通過大腸桿菌中異源表達peniA基因,獲得了可溶性的PeniA重組蛋白。體外酶活實驗表明,1)PeniA能夠催化法呢基焦磷酸(FPP)環(huán)化為化合物209,經(jīng)GC-MS數(shù)據(jù)庫比對確定,該化合物與角三環(huán)倍半萜silphinene的斷裂碎片一致;2)PeniA對FPP顯示出嚴格的底物選擇性,并不能催化GPP和GGPP生產(chǎn)對應的環(huán)化產(chǎn)物。酵母異源表達實驗證實,基因peniA的酵母高表達菌株能夠高效生產(chǎn)化合物209,進一步的分離與核磁鑒定證實209確實為三環(huán)倍半萜silphinene。因此,PeniA為之前并未報道過的silphinene倍半萜環(huán)化酶。通過對PeniA體外催化功能的研究以及silphinene結(jié)構(gòu)的確認,我們推導了PeniA催化FPP到silphinene的整個環(huán)化機理。化合物209的化學喂養(yǎng)結(jié)果表明,其能夠恢復ΔpeniA突變株penifulvin A的生產(chǎn)能力,從而證實了silphinene為penifulvin A合成的重要前體,這為后續(xù)氧化后修飾酶(PeniB和PeniC)催化功能的研究提供了重要的物質(zhì)支撐。(5)細胞色素P450氧化酶PeniB催化功能的研究。生物信息學分析顯示,PeniB為細胞色素P450單加氧酶。peniA和peniB基因的共表達A.nidulans菌株(AN-peniAB)產(chǎn)生三個產(chǎn)物,分別為silphinene-15-oic acid(203)、γ-lactone-2-hydroxy[5.5.5.5]fenestrane(210)和γ-lactone-2-keto[5.5.5.5]fenestrane(211),該結(jié)果說明,PeniB作為多功能P450氧化酶,其能夠連續(xù)催化silphinene的多步氧化反應。PeniB微粒體復合物的體外酶活實驗結(jié)果表明了PeniB的氧化過程,1)催化209中C-15位甲基的三步氧化反應得到羧基產(chǎn)物203;2)PeniB氧化化合物203得到化合物210;3)PeniB繼續(xù)催化化合物210 C-2羥基的脫氫反應得到211。化合物203/210/211分別化學喂養(yǎng)ΔpeniA突變株均能恢復penifulvin A的產(chǎn)生,由此證明了PeniB對化合物209的三步氧化產(chǎn)物均為penifulvin A生物合成的重要中間體,其中化合物203到化合物210的轉(zhuǎn)化過程,是構(gòu)建第一個γ-內(nèi)酯環(huán)的關(guān)鍵一步。由此,推導了PeniB可能通過催化化合物203 C-15位的羧基自由基加成C1-C2的雙鍵或者C-15的羧基進攻C1-C2位的環(huán)氧兩種機理得到210。為了驗證PeniB的反應機理,首先通過化學衍生的方法,獲得了化合物203的C-15羧基甲酯化產(chǎn)物214。PeniB與化合物214的體外酶活結(jié)果顯示,PeniB的催化活性被完全抑制,由此說明C-15位羧基自由基的生成對化合物210中γ-內(nèi)酯環(huán)的形成至關(guān)重要。(6)Baeyer-Villiger氧化酶PeniC催化功能的研究。從化合物211到最終產(chǎn)物penifulvin A,需要C1-C2位的位置專一選擇性的Baeyer-Villiger氧化反應。生物信息學分析表明,PeniC確實為核黃素依賴的Baeyer-Villiger氧化酶,其可能負責了化合物211到penifulvin A的轉(zhuǎn)化。peniA、peniB和peniC三個基因共表達A.nidulans(AN-peniABC)確實能夠檢測到終產(chǎn)物penifulvin A的產(chǎn)生。我們試圖在大腸桿菌中得到可溶性PeniC蛋白去驗證其催化化合物211到penifulvin A的轉(zhuǎn)化,但經(jīng)過多種嘗試,PeniC或者其與其它標簽的融合蛋白在大腸桿菌中均為不可溶表達�；衔�211分別喂養(yǎng)ΔpeniB及ΔpeniC突變株的實驗表明,211雖然能夠恢復ΔpeniB突變株penifulvin A的產(chǎn)生,但是其并不能恢復ΔpeniC突變株penifulvin A的產(chǎn)生。由此間接證明了PeniC是催化化合物211形成penifulvin A的關(guān)鍵酶,通過催化C1-C2位的Baeyer-Villiger氧化反應形成δ-內(nèi)酯環(huán)。(7)Penifulvin A生物合成途徑的推導。通過對peniA、peniB和peniC基因功能及其對應蛋白催化功能的研究,推導了penifulvin A生物合成的可能途徑,1)PeniA催化線性FPP前體環(huán)化得到角三環(huán)骨架倍半萜silphinene(209);2)PeniB催化209經(jīng)多步氧化反應得到211,其間完成了γ-內(nèi)酯環(huán)的構(gòu)建;3)PeniC催化211發(fā)生C1-C2位的Baeyer-Villiger氧化反應形成δ-內(nèi)酯環(huán),從而得到終產(chǎn)物penifulvin A。Penifulvin A生物合成途徑的闡明,為自然界中其它窗烷類天然產(chǎn)物生物合成的研究以及penifulvin類衍生物的合成生物學改造奠定了良好的基礎。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S482;Q78
【圖文】：

圖 1-1. 1981-2014 所有批準的新藥來源（n=1562）[1]Figure 1-1. Source of all new approved drugs during 1981-2014（n=1562）菌是一類低等真核細胞型微生物，其數(shù)量巨大、種類繁多，在生物界中是為天然藥物來源已有多年歷史。真菌來源廣泛，可以通過改進和控制發(fā)酵育等途徑提高所需化合物的產(chǎn)量，且不存在大量破壞生物資源等問題。因研究開發(fā)高效低毒且資源充足的藥物具有良好的前景。目前，從真菌次級經(jīng)相繼得到了大量的生物活性分子（或簡單的結(jié)構(gòu)修飾化合物），例如產(chǎn)[2]

西南大學博士學位論文白僵菌（Beauveria bassiana）來源的具有抗蟲活性的白僵菌素（beauverin，7）[8], 以及變色曲霉菌（Aspergillus versicolor）來源的腸道細菌耐藥酶抑制劑曲霉明 （aspergillomarasmine A，8）[9]等等，由此也說明了真菌作為創(chuàng)新藥物的開發(fā)來源具有巨大的潛力和重要的社會價值。

圖 1-18. 倍半萜環(huán)化酶的環(huán)化方式Figure 1-18. Cyclization of sesquiterpene cyclase（2）真菌倍半萜環(huán)化酶研究現(xiàn)狀基于對 JGI 數(shù)據(jù)庫中所測序的真菌基因組中萜類環(huán)化酶的生物信息學分析顯示，無論在子囊菌綱絲狀真菌（209 個基因組，2949 條萜類環(huán)化酶序列信息）還是在擔子菌綱高等真菌（113 個基因組，2485 條萜類環(huán)化酶序列信息）中，倍半萜合成酶均是最主要的環(huán)化酶類型（圖 1-19），且與子囊菌相比，擔子菌中的倍半萜環(huán)化酶相對更豐富[84]。但是，從已報道的真菌倍半萜環(huán)化酶來看，還有大量的倍半萜環(huán)化酶有待挖掘和鑒定。

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