【摘要】：RNA表達(dá)具有高度異質(zhì)性,準(zhǔn)確檢測(cè)RNA的表達(dá)豐度和空間位置能夠了解不同時(shí)期細(xì)胞和組織中各基因動(dòng)態(tài)表達(dá)情況,并可以更好地理解機(jī)體成分間的作用機(jī)制。本研究旨在開(kāi)發(fā)一種利用雙連接探針對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行定量定位分析的新型單分子RNA原位檢測(cè)技術(shù),并更高效地應(yīng)用構(gòu)建空間基因表達(dá)譜。在鎖式探針和滾環(huán)擴(kuò)增的基礎(chǔ)上,本研究主要?jiǎng)?chuàng)新在于設(shè)計(jì)新型探針-雙連接探針,通過(guò)考察驗(yàn)證雙連接探針的設(shè)計(jì)原則,測(cè)試比較檢測(cè)效率,并將其應(yīng)用到不同種類RNA的檢測(cè),建立了利用雙連接探針基于滾環(huán)擴(kuò)增的RNA原位檢測(cè)的方法。首先以ACTB管家基因?yàn)槟Ｐ?類比鎖式探針檢測(cè)反應(yīng),通過(guò)優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄、雙連接探針第一步連接和基于夾板的成環(huán)反應(yīng)體系,建立基于雙連接探針的RNA原位檢測(cè)基本方法。比較雙連接探針與鎖式探針的方法,得出雙連接探針檢測(cè)效率高于鎖式探針。然后將此方法擴(kuò)展到其他mRNA的檢測(cè),以在細(xì)胞爬片和病理組織切片中檢測(cè)KRAS和乳腺癌相關(guān)基因?yàn)槔?考察方法的特異性和穩(wěn)健性。而后將方法應(yīng)用到癌細(xì)胞lncRNA的多重檢測(cè)和mRNA與lncRNA的同時(shí)檢測(cè),再次證明方法的穩(wěn)健性。檢測(cè)lncRNA SNP位點(diǎn)時(shí),通過(guò)改變探針設(shè)計(jì)、清洗條件、連接酶和反應(yīng)體系,可使假陽(yáng)性率降低到1%以下。本文通過(guò)雙連接探針與鎖式探針多次比較實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證本方法更加高效。同時(shí)又通過(guò)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn),實(shí)現(xiàn)了較高的單堿基識(shí)別特異性。此方法可以結(jié)合多種原位測(cè)序技術(shù),實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞、單分子、單堿基水平上的RNA高度多重基因表達(dá)原位檢測(cè)。由于原位檢測(cè)結(jié)果與臨床信息的一致性,本方法優(yōu)化后有望成為應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床診斷的新技術(shù)。
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q522
【圖文】：

接著在靶序列上重復(fù)這種探針對(duì)單元，只是每組間的熒光團(tuán)顏色不同，這樣既可以增加信號(hào)點(diǎn)強(qiáng)度，又可以通過(guò)不同顏色的空間位置順序解碼對(duì)應(yīng)序列，進(jìn)而檢測(cè)出其對(duì)應(yīng)基因。第二種方法是基于不同顏色光譜的比例，無(wú)需知道具體的空間位置排列，通過(guò)已知檢測(cè)探針的熒光基團(tuán)比例讀出相應(yīng)基因型（圖 1.4）。雖然相比單種熒光標(biāo)記擴(kuò)大了檢測(cè)通量，但是此種方法仍然難以擴(kuò)展到 30 個(gè)基因以上。

接著在靶序列上重復(fù)這種探針對(duì)單元，只是每組間的熒光團(tuán)顏色不同，這樣既可以增加信號(hào)點(diǎn)強(qiáng)度，又可以通過(guò)不同顏色的空間位置順序解碼對(duì)應(yīng)序列，進(jìn)而檢測(cè)出其對(duì)應(yīng)基因。第二種方法是基于不同顏色光譜的比例，無(wú)需知道具體的空間位置排列，通過(guò)已知檢測(cè)探針的熒光基團(tuán)比例讀出相應(yīng)基因型（圖 1.4）。雖然相比單種熒光標(biāo)記擴(kuò)大了檢測(cè)通量，但是此種方法仍然難以擴(kuò)展到 30 個(gè)基因以上。圖 1.3 基于空間位置編碼 smFISH 原理

圖 1.3 基于空間位置編碼 smFISH 原理圖 1.4 基于光子比例編碼 smFISH 原理為了克服擴(kuò)展性問(wèn)題，LongCai[15]又開(kāi)發(fā)出了基于時(shí)間條形碼技術(shù)的順序熒光原位雜交技術(shù)（sequentialfluorescenceinsituhybridization，seqFISH），通過(guò)對(duì)同一 mRNA 分子進(jìn)行連續(xù)多輪相同堿基序列的探針雜交，通過(guò)每輪標(biāo)記不同顏色的熒光團(tuán)，以時(shí)間序列顏色順序進(jìn)行基因編碼（圖 1.5）。此方法可以通過(guò)增加與有限的熒光團(tuán)雜交的輪數(shù)來(lái)擴(kuò)展多重檢測(cè)能力。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周春燕;黃可可;任妹;劉劍榮;夏洪嬌;;探討LncRNA遺傳多態(tài)性及其與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的相關(guān)性[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新;2019年32期

2 楊湛;陳艾;胡良才;;LncRNA與新生兒缺氧缺血性腦病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];中國(guó)婦幼健康研究;2019年11期

3 楊思琦;姚頤;宋啟斌;;非小細(xì)胞肺癌中LncRNA表達(dá)的研究現(xiàn)狀[J];中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2019年32期

4 桑園園;楊承健;韓志君;;LncRNA與心血管疾病的研究進(jìn)展[J];臨床與病理雜志;2016年10期

5 馬驤;歐陽(yáng)堯明;景在平;周建;;lncRNA在血管疾病中的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)普通外科雜志;2016年12期

6 劉慧;王德瑩;孫海珠;邱曉紅;;子宮內(nèi)膜異位癥中LncRNA的研究進(jìn)展[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2017年01期

7 陳偉;戴偉鋼;張常華;何裕隆;;LncRNA在胃癌中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值[J];消化腫瘤雜志(電子版);2016年04期

8 顏晗;譚丹;謝攀;劉昭前;李曦;;多種lncRNA可影響黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2017年02期

9 汪翔;吳強(qiáng);李慶中;李維平;;LncRNA在惡性腦膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2017年01期

10 王祖森;沈h牖

本文編號(hào)：2786939