【摘要】：RNA表達具有高度異質(zhì)性,準確檢測RNA的表達豐度和空間位置能夠了解不同時期細胞和組織中各基因動態(tài)表達情況,并可以更好地理解機體成分間的作用機制。本研究旨在開發(fā)一種利用雙連接探針對目標基因的表達進行定量定位分析的新型單分子RNA原位檢測技術,并更高效地應用構建空間基因表達譜。在鎖式探針和滾環(huán)擴增的基礎上,本研究主要創(chuàng)新在于設計新型探針-雙連接探針,通過考察驗證雙連接探針的設計原則,測試比較檢測效率,并將其應用到不同種類RNA的檢測,建立了利用雙連接探針基于滾環(huán)擴增的RNA原位檢測的方法。首先以ACTB管家基因為模型,類比鎖式探針檢測反應,通過優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄、雙連接探針第一步連接和基于夾板的成環(huán)反應體系,建立基于雙連接探針的RNA原位檢測基本方法。比較雙連接探針與鎖式探針的方法,得出雙連接探針檢測效率高于鎖式探針。然后將此方法擴展到其他mRNA的檢測,以在細胞爬片和病理組織切片中檢測KRAS和乳腺癌相關基因為例,考察方法的特異性和穩(wěn)健性。而后將方法應用到癌細胞lncRNA的多重檢測和mRNA與lncRNA的同時檢測,再次證明方法的穩(wěn)健性。檢測lncRNA SNP位點時,通過改變探針設計、清洗條件、連接酶和反應體系,可使假陽性率降低到1%以下。本文通過雙連接探針與鎖式探針多次比較實驗,驗證本方法更加高效。同時又通過SNP位點的檢測實驗,實現(xiàn)了較高的單堿基識別特異性。此方法可以結合多種原位測序技術,實現(xiàn)在單細胞、單分子、單堿基水平上的RNA高度多重基因表達原位檢測。由于原位檢測結果與臨床信息的一致性,本方法優(yōu)化后有望成為應用于基礎研究和臨床診斷的新技術。
【學位授予單位】：華僑大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q522
【圖文】：

接著在靶序列上重復這種探針對單元，只是每組間的熒光團顏色不同，這樣既可以增加信號點強度，又可以通過不同顏色的空間位置順序解碼對應序列，進而檢測出其對應基因。第二種方法是基于不同顏色光譜的比例，無需知道具體的空間位置排列，通過已知檢測探針的熒光基團比例讀出相應基因型（圖 1.4）。雖然相比單種熒光標記擴大了檢測通量，但是此種方法仍然難以擴展到 30 個基因以上。

接著在靶序列上重復這種探針對單元，只是每組間的熒光團顏色不同，這樣既可以增加信號點強度，又可以通過不同顏色的空間位置順序解碼對應序列，進而檢測出其對應基因。第二種方法是基于不同顏色光譜的比例，無需知道具體的空間位置排列，通過已知檢測探針的熒光基團比例讀出相應基因型（圖 1.4）。雖然相比單種熒光標記擴大了檢測通量，但是此種方法仍然難以擴展到 30 個基因以上。圖 1.3 基于空間位置編碼 smFISH 原理

圖 1.3 基于空間位置編碼 smFISH 原理圖 1.4 基于光子比例編碼 smFISH 原理為了克服擴展性問題，LongCai[15]又開發(fā)出了基于時間條形碼技術的順序熒光原位雜交技術（sequentialfluorescenceinsituhybridization，seqFISH），通過對同一 mRNA 分子進行連續(xù)多輪相同堿基序列的探針雜交，通過每輪標記不同顏色的熒光團，以時間序列顏色順序進行基因編碼（圖 1.5）。此方法可以通過增加與有限的熒光團雜交的輪數(shù)來擴展多重檢測能力。

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本文編號：2786939