【摘要】：薄皮甜瓜(Cucumis melo var.makuwa Makino)是葫蘆科甜瓜屬(Cucumis melo L.)一年生草本植物,在設(shè)施栽培中,其產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重受到非生物脅迫的影響。前人研究發(fā)現(xiàn)脂氧合酶(Lipoxygenase,LOXs)在植物應(yīng)答非生物脅迫中具有重要的作用,因此研究LOX基因的功能可為通過基因工程提高薄皮甜瓜抗逆性提供一定的理論基礎(chǔ)。盡管最近幾十年來越來越多的植物中發(fā)現(xiàn)了新的LOX基因,但是對于薄皮甜瓜中LOXs基因的研究較少。本文以薄皮甜瓜'玉美人'為材料,通過PCR技術(shù)克隆了 CmLOX08的基因編碼區(qū)序列,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;利用煙草瞬時表達(dá)的方法鑒定了CmLOX08的亞細(xì)胞定位;通過PlantCARE和PLACE數(shù)據(jù)庫分析CmLOX08啟動子中與信號物質(zhì)和非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件,并利用煙草瞬時表達(dá)方法對CmLOX08的啟動子進(jìn)行了功能分析;利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技術(shù)沉默CmLOX08,探索了 CmLOX08在干旱和鹽脅迫中的功能,同時將CmLOX08在擬南芥中過表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證其功能。主要結(jié)果如下:1.從甜瓜葉片中克隆了 CmLOX08基因序列,CmLOX08的ORF長度為2790 bp,編碼929個氨基酸,分子量為104.93 kDa,等電點(diǎn)為8.44。CmLOX08蛋白具有脂氧合酶家族的LOX保守結(jié)構(gòu)域,以及與脂氧合酶相關(guān)的PLAT_LH2和LH2保守結(jié)構(gòu)域,推測其為13S-LOXs。使用Infusion方法構(gòu)建CmLOX08過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中,通過在煙草葉片中瞬時表達(dá),發(fā)現(xiàn)CmLOX08蛋白定位在細(xì)胞膜上。2.通過PCR技術(shù)獲得了 CmLOX08啟動子序列,并且利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測啟動子序列上的順式作用元件。CmLOX08啟動子序列長度為2054 bp,與甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫中GeLOX08-pro的核苷酸序列具有99.61%的同源性。利用在線軟件PlantCARE和PLACE分析CmLOX08啟動子序列,發(fā)現(xiàn)了 30種與信號物質(zhì)和非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件,如與脫落酸(ABA)響應(yīng)相關(guān)的ABRE元件,與干旱響應(yīng)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)以及與鹽脅迫相關(guān)的GT1GMSCAM4元件等。3.根據(jù)順式作用元件的位置,構(gòu)建薄皮甜瓜CmLOX08 5'缺失啟動子植物表達(dá)載體,通過注射法在煙草葉片中瞬時表達(dá)后,對煙草葉片進(jìn)行信號物質(zhì)和非生物脅迫處理。GUS組織化學(xué)染色和熒光定量分析表明,除茉莉酸甲酯外,信號物質(zhì)脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)和過氧化氫(H2O2)均可調(diào)節(jié)CmLOX08啟動子的活性;在鹽、干旱和機(jī)械損傷處理下,-1047～-1-bp啟動子區(qū)域誘導(dǎo)GUS活性最高,是響應(yīng)3種脅迫的主要區(qū)段;同樣,研究發(fā)現(xiàn)啟動子中-1284～-1-bp和-1047～-1-bp區(qū)段分別是應(yīng)答高溫和低溫的核心序列。以上結(jié)果表明,CmLOX08啟動子的活性受各種信號分子和非生物脅迫的調(diào)節(jié),是一個信號分子/脅迫誘導(dǎo)型啟動子。4.利用VIGS技術(shù)并結(jié)合甜瓜子葉注射法,沉默CmLOX08;構(gòu)建CmLOX08過表達(dá)載體,通過花序浸潤法轉(zhuǎn)化擬南芥。對沉默植株和轉(zhuǎn)CmLOX08擬南芥進(jìn)行干旱處理,發(fā)現(xiàn)與對照植株相比,CmLOX08沉默植株的LOX活性和脅迫基因表達(dá)水平降低,H2O2積累增加,對干旱脅迫更加敏感;相反,過表達(dá)CmLOX08增強(qiáng)了擬南芥對干旱脅迫的抗性,減少了氧化傷害,提高了 LOX活性和脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。因此,CmLOX08可能通過調(diào)控LOX活性、H2O2積累和脅迫基因表達(dá)水平來提高對干旱的抗性。5.對沉默植株和轉(zhuǎn)CmLOX08擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理,發(fā)現(xiàn)與對照植株相比,CmLOX08沉默植株的LOX活性和脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)受到抑制,H2O2的積累增加,降低了對鹽脅迫的抗性;然而,轉(zhuǎn)CmLOX08擬南芥的LOX活性和脅迫基因表達(dá)水平始終高于野生型,H2O2的積累較少,表現(xiàn)出更好的耐鹽性;此外,沉默CmLOX08能夠顯著降低葉片中JA含量,同樣,過表達(dá)CmLOX08顯著提高葉片中JA含量。這些結(jié)果表明了 CmLOX08可能通過調(diào)控LOX活性、H2O2積累、脅迫基因表達(dá)水平以及JA水平來提高對鹽脅迫的抗性。綜上,CmLOX08基因的ORF長度為2790 bp,定位在細(xì)胞膜上;CmLOX08啟動子的活性受信號物質(zhì)脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)和過氧化氫(H2O2)以及非生物脅迫干旱、鹽、機(jī)械損傷、高低溫的調(diào)節(jié);CmLOX08通過提高LOX活性、脅迫基因表達(dá)水平和清除活性氧能力來增強(qiáng)植物的抗旱和抗鹽性,且抗鹽性的提高與JA水平有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S652;Q943.2
【圖文】：

二．燥氧化物含酶（Ａｌｌｅｎｅ邋ｏｘｉｄｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＯＳ）支路。ＨＰＬｆ＾夠催逡逑化脂肪酸碳骨架氧化裂解，形成Ｃ６或Ｃ９醛、醇和相應(yīng)的Ｃ１２和Ｃ９脂肪酸等揮發(fā)性物逡逑質(zhì)（ＧＬＶｓ）。如圖１－１所示，ＬＯＸ催化底物亞麻酸碳?xì)涔羌艿模茫购停茫保澄稽c(diǎn)的過氧逡逑化反應(yīng)，產(chǎn)物為９－氫過氧化物（９－ＨＰ０Ｔ）和１３－氫過氧化物（１３－ＨＰ０Ｔ）。９－氫過氧化逡逑物經(jīng)過氫過氧化物裂解酶、醇脫氫酶催化最終生成Ｃ９醛、醇揮發(fā)性物質(zhì)，１３－ＨＰ０Ｔ最逡逑終生成Ｃ６醛、醇。在逆境脅迫下，Ｃ６綠葉揮發(fā)物不僅能夠促進(jìn)脅迫相關(guān)基因表達(dá)（Ｂａｔｅ逡逑ａｎｄ邋Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９９８），．并：且能夠激發(fā)抗病h澘浯跡ǎ校潁錚螅翦澹澹翦澹幔歟�，２００�(dān)�。１３－脂翁簭B稿義希ǎ保常蹋希兀┐呋幔瓈r：麻酸產(chǎn)生１３－ＨＰＯＴ，然后在ＡＯＳ和ＡＯＣ的作用下生成１２－氧－植逡逑物二P懰幔ǎ保玻錚錚穡瑁簦錚洌椋澹睿錚椋沐澹幔悖椋�，ＯＰＤＡ〉。随后，莱莉酸討劐ＯＰＤｂ忂娺b海保玻酰參鋃義舷┧嶧乖傅淖饔孟戮陳鄭醒躉銑

本文編號：2785267