【摘要】：前期本實(shí)驗(yàn)室建立了基于擬南芥熱誘導(dǎo)基因HSP18.2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲螢光素酶(HSP18.2:LUC)活性變化的突變體篩選方法,篩選得到高溫下螢光增強(qiáng)的突變體tawd(Thermotolerance Associated WD40 repeat protein)。該突變體在高溫處理后與野生型相比表現(xiàn)出高螢光素酶活性和對(duì)高溫敏感。用圖位克隆的方法克隆到了突變基因TAWD。該基因編碼一個(gè)含WD40重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(WD40 repeat protein,WDR)的蛋白,在本文中命名為TAWD,它在擬南芥各組織中組成型表達(dá)。WD40蛋白家族成員作為生物大分子相互作用的支架蛋白,在真核生物中廣泛存在,在擬南芥中參與植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過程,被認(rèn)為是發(fā)育和脅迫信號(hào)傳遞過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。本文通過耐熱實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)tawd的基礎(chǔ)耐熱性和獲得性耐熱能力與野生型相比減弱了。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)TAWD主要分布在細(xì)胞核中,在細(xì)胞中的分布不受高溫的影響。雖然正常培養(yǎng)條件下TAWD在野生型中表達(dá)量較低并受高溫抑制,但通過免疫印跡(Western Blot)定量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高溫條件下TAWD的翻譯水平與正常培養(yǎng)溫度下的相比逐漸上調(diào)。熱脅迫條件下,大多數(shù)熱激響應(yīng)(HSR)基因,如熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)、熱激蛋白(HSPs)等在tawd中的轉(zhuǎn)錄水平和野生型中的相比下調(diào)了。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)檢測(cè)到TAWD與HSP89.1的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。這些結(jié)果說明TAWD是植物耐熱所必需的,在參與HSR基因表達(dá)調(diào)控過程中主要起正調(diào)控作用。通過RNA免疫共沉淀(RIP)技術(shù)檢測(cè)到TAWD與HSP18.和HSP101的mRNA有結(jié)合,如前述,高溫脅迫下HSP18.2,HSP101的轉(zhuǎn)錄水平在tawd中與在野生型相比下調(diào)了,推測(cè)TAWD可能參與維持mRNA穩(wěn)定性。另外,受到熱脅迫后,tawd中HSFA7a,HSFAb和HSFB1等HSFs基因mRNA的內(nèi)含子保留增加了,這說明TAWD可能參與調(diào)控mRNA的可變剪接。最后,我們通過免疫沉淀和質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)鑒定到TAWD與HSP70-1、HSP90.2等蛋白相互作用,前人研究顯示擬南芥HSP70-1與輔助分子伴侶BAG4有相互作用。因此,我們進(jìn)一步利用雙分子螢光素酶的互補(bǔ)(Bimolecular Luciferase complementation,BiLC)實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)分析了它們的互作,但沒有檢測(cè)到TAWD與HSP70-1、BAG4、HSP90.2等的直接相互作用。我們還創(chuàng)建了tawd、hsp70-1、bag4的多突變體材料,分析它們的LUC活性變化發(fā)現(xiàn)tawd/hsp70-1、tawdbag4、tawd/hsp70-1/bag4雙突變體和三突變體的LUC活性表現(xiàn)出和tawd類似的變化,在高溫脅迫下升高;耐熱分析的結(jié)果顯示,tawdhsp70-1和tawd/bag4與tawd相比在高溫脅迫后的存活率上升了,而tawd/hsp70-1/bag4三突變體的耐熱性比野生型更強(qiáng)。這些結(jié)果說明TAWD、HSP70-1和BAG4共同參與調(diào)控植物的耐熱性。綜上所述,TAWD可能作為一個(gè)熱激響應(yīng)的信號(hào)整合因子,在參與植物耐熱性的調(diào)控過程中起著非常重要的作用。首先,TAWD參與調(diào)控HSR基因的表達(dá),通過直接與HSP89.1啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件結(jié)合調(diào)控它的轉(zhuǎn)錄;其次TAWD可能參與維持HSR基因的mRNA穩(wěn)定性和調(diào)控RNA的可變剪接,高溫脅迫下,在tawd中檢測(cè)到HSP18.2和HSPl01表達(dá)下調(diào)和RIP檢測(cè)到TAWD與HSP18.2和HSP101的mRNA結(jié)合,同時(shí)熱脅迫下HSFA2、HSFA7a等HSFs在tawd中出現(xiàn)內(nèi)含子保留增加的剪接變化;最后,TAWD、HSP70-1和BAG4共同參與調(diào)控植物的耐熱性,同時(shí)敲除TAWD、HSP70-1和BAG4可顯著提高植物的耐熱性。TAWD可能通過調(diào)控HSR基因的表達(dá),與HSP70-1和BAG4—起參與調(diào)節(jié)植物的耐熱性,提高植物在高溫環(huán)境下的適應(yīng)能力。
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2
【圖文】：

１．２熱激轉(zhuǎn)錄因子及其功能逡逑以擬南芥為例，根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的不同將其２１個(gè)ＨＳＦ基因所編碼的蛋白分、Ｂ和０３類［１１’１８］。ＨＳＦＡｓ被認(rèn)為是熱誘導(dǎo)基因激活的主要調(diào)節(jié)因子；ＨＳＦＢｓ熱誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活功能，但有正常的ＤＮＡ結(jié)合功能，可能輔助ＨＳＦＡｓ起調(diào)節(jié)，ＨＳＦＣｓ的功能暫時(shí)不清楚＾＾’＾＇耶尺基因的啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)保守的元件（Ｈｅａｔ邋Ｓｔｒｅｓｓ邋Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＨＳＥ）：邋５’－ＡＧＡＡｎｎＴＴＣＴ－３’，ＨＳＦｓ邋可以識(shí)別這種邋ＨＳＥＳＦＡｌｓ被預(yù)測(cè)直接參與重要的熱激轉(zhuǎn)錄因子兒份為２、份仰的表達(dá)［２＼ＨＳＦＡｌａ在番茄中組成型表達(dá)，調(diào)控／／５７Ｍ和好＾５７的表達(dá)［２１］。逡逑ＳＦＡ２和ＨＳＦＡｌａ功能相似［２２］，但ＨＳＦＡ２只在受到脅迫時(shí)候表達(dá)，在擬南芥中達(dá)ＨＳＦＡ２可以提高其耐熱性［１１］，也有研究發(fā)現(xiàn)ＨＳＦＡ２還參與鹽脅迫［２３］和氧化［２４］。所以ＨＳＦＡ２是一個(gè)植物逆境脅迫響應(yīng)與應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。ＨＳＦｓ受上因的調(diào)控，例如擬南芥ＤＲＥＢ２Ｃ通過激活的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控植物的耐熱性［２５脅迫條件下，擬南芥ＲＣＦ２與ＮＡＣ０１９結(jié)合使ＮＡＣ０１９去磷酸化后其功能被激活，逡逑ＮＡＣ０１９直接與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合正向調(diào)控／／５及７６、等的表達(dá)［２６］

Ａ：正常培養(yǎng)條件下的幼苗作為對(duì)照；Ｂ，Ｄ：基礎(chǔ)性耐熱實(shí)驗(yàn)，在４２°Ｃ分別處理３小時(shí)（Ｂ）逡逑和６小時(shí)（Ｄ），然后在正常培養(yǎng)條件恢復(fù)培養(yǎng)５天后的狀態(tài)和存活率統(tǒng)計(jì)分析；Ｃ，Ｅ：獲得性逡逑耐熱實(shí)驗(yàn)，先在３８°Ｃ處理１小時(shí)后正常培養(yǎng)溫度恢復(fù)２小時(shí)，接著分別在４２°Ｃ處理３小時(shí)（Ｃ）逡逑和６小時(shí)（Ｅ），恢復(fù)５天后的狀態(tài)和存活率。所有實(shí)驗(yàn)都至少有３次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)，并得到逡逑一樣的結(jié)果，選取其中一次的結(jié)果在此展示。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１．邋Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔａｗｄ．邋ｕｎｄｅｒ邋ｈｅａｔ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．逡逑Ａ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｕｎｄｅｒ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ；邋Ｂ，邋Ｄ：邋Ｂａｓａｌ邋ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ邋ａｓｓａｙｓ，邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ逡逑１８逡逑

Ａ：邋５天大的幼苗的根毛細(xì)胞和下胚軸細(xì)胞在熒光顯微鏡下的觀察情況；Ｂ：邋５天大別在３８°Ｃ和４２°Ｃ處理１小時(shí)后在葉表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位情況。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２．邋Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＴＡＷＤ－ＹＦＰ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．逡逑Ａ：邋Ｒｏｏｔ邋ｈａｉｒ邋ａｎｄ邋ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ邋ｂｙ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｒｏｓｃｏｐｅ；邋Ｂ：邋Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｌｅａｆ邋ｅｐｉｄｅｒｍａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋0Ｃ邋ａｎｄ邋４２邋0Ｃ邋ｆｏｒ邋１邋ｈｏｕｒ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．逡逑３．２邋ＴＡＷＤ參與調(diào)控基因表達(dá)逡逑３．２．１邐突變導(dǎo)致ＬＵＣ活性增加逡逑野生型和中含報(bào)告系統(tǒng)，熱激后中ＬＵＣ活性被激野生型被抑制。：ＷｆＦＤ基因發(fā)生突變后為什么會(huì)導(dǎo)致ＬＵＣ活性增強(qiáng)我們不清是我們進(jìn)行了邋ＲＴ－ＰＣＲ和ｑＲＴ－ＰＣＲ實(shí)驗(yàn)。分別將２周大的幼苗在３８°Ｃ處理０，１小時(shí)，３小時(shí)后提取ＲＮＡ后進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ，利用半定量和ｑＲＴ－ＰＣＲ的方法了邐ＺＵＣ和ＭＦＺ）基因在野生型、ｔｏＷ和互補(bǔ)材料ｔｏｍ／－ｃｏ／ｗ中轉(zhuǎn)錄上的變化，結(jié)果如下：逡逑，ｔｏｗｄＺＣ／Ｃ，

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 劉愛麗;采用酵母雙雜交技術(shù)篩選熱激反應(yīng)相關(guān)剪接因子的互作蛋白[D];華中師范大學(xué);2016年

2 田亞苗;擬南芥熱激基因表達(dá)調(diào)控因子的基因克隆及初步功能分析[D];華中師范大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2770832