發(fā)布時間：2020-07-26 13:42

【摘要】：前期本實驗室建立了基于擬南芥熱誘導基因HSP18.2啟動子驅動的螢火蟲螢光素酶(HSP18.2:LUC)活性變化的突變體篩選方法,篩選得到高溫下螢光增強的突變體tawd(Thermotolerance Associated WD40 repeat protein)。該突變體在高溫處理后與野生型相比表現出高螢光素酶活性和對高溫敏感。用圖位克隆的方法克隆到了突變基因TAWD。該基因編碼一個含WD40重復序列結構域(WD40 repeat protein,WDR)的蛋白,在本文中命名為TAWD,它在擬南芥各組織中組成型表達。WD40蛋白家族成員作為生物大分子相互作用的支架蛋白,在真核生物中廣泛存在,在擬南芥中參與植物的生長和發(fā)育過程,被認為是發(fā)育和脅迫信號傳遞過程中的關鍵調控因子。本文通過耐熱實驗發(fā)現tawd的基礎耐熱性和獲得性耐熱能力與野生型相比減弱了。亞細胞定位發(fā)現TAWD主要分布在細胞核中,在細胞中的分布不受高溫的影響。雖然正常培養(yǎng)條件下TAWD在野生型中表達量較低并受高溫抑制,但通過免疫印跡(Western Blot)定量實驗發(fā)現高溫條件下TAWD的翻譯水平與正常培養(yǎng)溫度下的相比逐漸上調。熱脅迫條件下,大多數熱激響應(HSR)基因,如熱激轉錄因子(HSFs)、熱激蛋白(HSPs)等在tawd中的轉錄水平和野生型中的相比下調了。通過染色質免疫共沉淀(ChIP)技術檢測到TAWD與HSP89.1的啟動子區(qū)結合。這些結果說明TAWD是植物耐熱所必需的,在參與HSR基因表達調控過程中主要起正調控作用。通過RNA免疫共沉淀(RIP)技術檢測到TAWD與HSP18.和HSP101的mRNA有結合,如前述,高溫脅迫下HSP18.2,HSP101的轉錄水平在tawd中與在野生型相比下調了,推測TAWD可能參與維持mRNA穩(wěn)定性。另外,受到熱脅迫后,tawd中HSFA7a,HSFAb和HSFB1等HSFs基因mRNA的內含子保留增加了,這說明TAWD可能參與調控mRNA的可變剪接。最后,我們通過免疫沉淀和質譜聯用的技術鑒定到TAWD與HSP70-1、HSP90.2等蛋白相互作用,前人研究顯示擬南芥HSP70-1與輔助分子伴侶BAG4有相互作用。因此,我們進一步利用雙分子螢光素酶的互補(Bimolecular Luciferase complementation,BiLC)實驗和免疫共沉淀(Co-IP)技術分析了它們的互作,但沒有檢測到TAWD與HSP70-1、BAG4、HSP90.2等的直接相互作用。我們還創(chuàng)建了tawd、hsp70-1、bag4的多突變體材料,分析它們的LUC活性變化發(fā)現tawd/hsp70-1、tawdbag4、tawd/hsp70-1/bag4雙突變體和三突變體的LUC活性表現出和tawd類似的變化,在高溫脅迫下升高;耐熱分析的結果顯示,tawdhsp70-1和tawd/bag4與tawd相比在高溫脅迫后的存活率上升了,而tawd/hsp70-1/bag4三突變體的耐熱性比野生型更強。這些結果說明TAWD、HSP70-1和BAG4共同參與調控植物的耐熱性。綜上所述,TAWD可能作為一個熱激響應的信號整合因子,在參與植物耐熱性的調控過程中起著非常重要的作用。首先,TAWD參與調控HSR基因的表達,通過直接與HSP89.1啟動子區(qū)域的順式元件結合調控它的轉錄;其次TAWD可能參與維持HSR基因的mRNA穩(wěn)定性和調控RNA的可變剪接,高溫脅迫下,在tawd中檢測到HSP18.2和HSPl01表達下調和RIP檢測到TAWD與HSP18.2和HSP101的mRNA結合,同時熱脅迫下HSFA2、HSFA7a等HSFs在tawd中出現內含子保留增加的剪接變化;最后,TAWD、HSP70-1和BAG4共同參與調控植物的耐熱性,同時敲除TAWD、HSP70-1和BAG4可顯著提高植物的耐熱性。TAWD可能通過調控HSR基因的表達,與HSP70-1和BAG4—起參與調節(jié)植物的耐熱性,提高植物在高溫環(huán)境下的適應能力。
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2
【圖文】：

１．２熱激轉錄因子及其功能逡逑以擬南芥為例，根據所含結構域的不同將其２１個ＨＳＦ基因所編碼的蛋白分、Ｂ和０３類［１１’１８］。ＨＳＦＡｓ被認為是熱誘導基因激活的主要調節(jié)因子；ＨＳＦＢｓ熱誘導的轉錄激活功能，但有正常的ＤＮＡ結合功能，可能輔助ＨＳＦＡｓ起調節(jié)，ＨＳＦＣｓ的功能暫時不清楚＾＾’＾＇耶尺基因的啟動子區(qū)域有一個保守的元件（Ｈｅａｔ邋Ｓｔｒｅｓｓ邋Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＨＳＥ）：邋５’－ＡＧＡＡｎｎＴＴＣＴ－３’，ＨＳＦｓ邋可以識別這種邋ＨＳＥＳＦＡｌｓ被預測直接參與重要的熱激轉錄因子兒份為２、份仰的表達［２＼ＨＳＦＡｌａ在番茄中組成型表達，調控／／５７Ｍ和好＾５７的表達［２１］。逡逑ＳＦＡ２和ＨＳＦＡｌａ功能相似［２２］，但ＨＳＦＡ２只在受到脅迫時候表達，在擬南芥中達ＨＳＦＡ２可以提高其耐熱性［１１］，也有研究發(fā)現ＨＳＦＡ２還參與鹽脅迫［２３］和氧化［２４］。所以ＨＳＦＡ２是一個植物逆境脅迫響應與應答的關鍵調節(jié)因子。ＨＳＦｓ受上因的調控，例如擬南芥ＤＲＥＢ２Ｃ通過激活的表達進而調控植物的耐熱性［２５脅迫條件下，擬南芥ＲＣＦ２與ＮＡＣ０１９結合使ＮＡＣ０１９去磷酸化后其功能被激活，逡逑ＮＡＣ０１９直接與啟動子區(qū)域結合正向調控／／５及７６、等的表達［２６］

Ａ：正常培養(yǎng)條件下的幼苗作為對照；Ｂ，Ｄ：基礎性耐熱實驗，在４２°Ｃ分別處理３小時（Ｂ）逡逑和６小時（Ｄ），然后在正常培養(yǎng)條件恢復培養(yǎng)５天后的狀態(tài)和存活率統(tǒng)計分析；Ｃ，Ｅ：獲得性逡逑耐熱實驗，先在３８°Ｃ處理１小時后正常培養(yǎng)溫度恢復２小時，接著分別在４２°Ｃ處理３小時（Ｃ）逡逑和６小時（Ｅ），恢復５天后的狀態(tài)和存活率。所有實驗都至少有３次獨立生物學重復，并得到逡逑一樣的結果，選取其中一次的結果在此展示。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１．邋Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔａｗｄ．邋ｕｎｄｅｒ邋ｈｅａｔ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．逡逑Ａ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｕｎｄｅｒ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ；邋Ｂ，邋Ｄ：邋Ｂａｓａｌ邋ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ邋ａｓｓａｙｓ，邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ逡逑１８逡逑

Ａ：邋５天大的幼苗的根毛細胞和下胚軸細胞在熒光顯微鏡下的觀察情況；Ｂ：邋５天大別在３８°Ｃ和４２°Ｃ處理１小時后在葉表皮細胞的亞細胞定位情況。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２．邋Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＴＡＷＤ－ＹＦＰ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．逡逑Ａ：邋Ｒｏｏｔ邋ｈａｉｒ邋ａｎｄ邋ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ邋ｂｙ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｒｏｓｃｏｐｅ；邋Ｂ：邋Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｌｅａｆ邋ｅｐｉｄｅｒｍａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋0Ｃ邋ａｎｄ邋４２邋0Ｃ邋ｆｏｒ邋１邋ｈｏｕｒ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．逡逑３．２邋ＴＡＷＤ參與調控基因表達逡逑３．２．１邐突變導致ＬＵＣ活性增加逡逑野生型和中含報告系統(tǒng)，熱激后中ＬＵＣ活性被激野生型被抑制。：ＷｆＦＤ基因發(fā)生突變后為什么會導致ＬＵＣ活性增強我們不清是我們進行了邋ＲＴ－ＰＣＲ和ｑＲＴ－ＰＣＲ實驗。分別將２周大的幼苗在３８°Ｃ處理０，１小時，３小時后提�。遥危梁筮M行ＲＴ－ＰＣＲ，利用半定量和ｑＲＴ－ＰＣＲ的方法了邐ＺＵＣ和ＭＦＺ）基因在野生型、ｔｏＷ和互補材料ｔｏｍ／－ｃｏ／ｗ中轉錄上的變化，結果如下：逡逑，ｔｏｗｄＺＣ／Ｃ，

【參考文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 劉愛麗;采用酵母雙雜交技術篩選熱激反應相關剪接因子的互作蛋白[D];華中師范大學;2016年

2 田亞苗;擬南芥熱激基因表達調控因子的基因克隆及初步功能分析[D];華中師范大學;2015年

本文編號：2770832