【摘要】：致病桿菌屬(Xenorhabdus sp.)是一類與斯氏線蟲(Steinernema sp.)互惠共生的昆蟲病原共生菌,能夠分泌多種殺蟲、抑菌和抗腫瘤的活性代謝產(chǎn)物,干擾宿主的免疫反應(yīng),導(dǎo)致昆蟲宿主死亡。課題組在前期研究中,通過對(duì)X.stockiae HN_xs01菌株進(jìn)行Fosmid基因組文庫的構(gòu)建,從中篩選出復(fù)合毒素SrfABC,對(duì)昆蟲細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均具有明顯毒性,并且發(fā)現(xiàn)三組分蛋白之間具有相互作用。本文對(duì)SrfABC復(fù)合毒素各組分的活性及其作用機(jī)理進(jìn)行了研究,為該類毒素在致病桿菌對(duì)昆蟲致病及抗腫瘤活性中的功能奠定了基礎(chǔ)。本研究利用GST標(biāo)簽單獨(dú)表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)SrfA、SrfB、SrfC蛋白,通過生測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SrfA、SrfB、SrfC蛋白對(duì)棉鈴蟲均具有注射毒性,且三者混合時(shí)毒性最大。我們以樅色卷蛾中腸細(xì)胞系CF-203/2.5和人宮頸癌細(xì)胞系HeLa為作用靶標(biāo),利用倒置顯微鏡和MTT法發(fā)現(xiàn)SrfA、SrfB、SrfC蛋白均能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞皺縮死亡,具有明顯細(xì)胞毒性,且三者混合作用時(shí)毒性最大。通過Hoechst/PI雙染和流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)SrfA、SrfB、SrfC蛋白均能破壞CF-203/2.5細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性,造成細(xì)胞凋亡,且三者混合作用時(shí)對(duì)細(xì)胞膜完整性破壞最大,凋亡率最高,并且三種蛋白均能將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。接下來,我們對(duì)SrfABC毒素各組分在細(xì)胞中的定位進(jìn)行了研究。免疫熒光結(jié)果顯示:CF203細(xì)胞中,SrfA、SrfB、SrfC蛋白單獨(dú)或混合作用,均集中分布在細(xì)胞質(zhì);在HeLa細(xì)胞中,SrfA蛋白集中分布在細(xì)胞質(zhì),SrfB蛋白集中分布在細(xì)胞核,SrfC蛋白單獨(dú)作用時(shí)分布在細(xì)胞質(zhì),混合作用時(shí)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。通過Western blot驗(yàn)證了SrfA、SrfB、SrfC蛋白單獨(dú)或混合作用,均能較高效率的、主動(dòng)進(jìn)入昆蟲細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。為了研究SrfABC毒素各組分的作用機(jī)制,我們將SrfA,SrfB,SrfC分別轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞HeLa和昆蟲細(xì)胞Sf9中。實(shí)驗(yàn)表明:SrfA,SrfB,SrfC蛋白均在HeLa細(xì)胞中成功表達(dá);利用免疫沉淀及質(zhì)譜技術(shù)篩選出其結(jié)合蛋白主要為骨架蛋白;Western Blot檢測顯示:SrfA蛋白轉(zhuǎn)染進(jìn)HeLa細(xì)胞后,除了目的條帶外,還檢測到分子量大于SrfA蛋白的條帶,推測是SrfA蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生翻譯后修飾,通過定點(diǎn)突變和糖苷酶處理,初步排除了糖基化修飾的可能性。本文探究了SrfABC毒素對(duì)人腫瘤細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞毒性,探明各組分的定位。初步分析了三元復(fù)合毒素的酶活性組分,初步研究了SrfABC類毒素在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性的作用機(jī)理,為該類毒素在致病桿菌對(duì)病原微生物抵抗宿主防御、毒力發(fā)揮及宿主定殖中的研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q93
【圖文】：

碩士學(xué)位論文24圖3-1 SrfA蛋白電泳檢測Fig 3-1 SDS-PAGE of SrfA ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脫液第三章 結(jié)果和分析3.1 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白的純化將誘導(dǎo)表達(dá)后的三種蛋白質(zhì)上清用 0.22 μm 濾膜過濾，用 10 倍柱體積的清洗緩沖液清洗 GST 瓊脂糖樹脂，加入蛋白裂解液 5 mL，封閉底部，4℃結(jié)合 6 h，加入 5 倍柱體積的洗滌緩沖液洗脫蛋白，重復(fù)洗脫一次，加入 2 倍柱體 Elution buffer 洗脫，收集蛋白，重復(fù)洗脫三次，收集洗脫液，進(jìn)行 SDS-PAGE檢測。純化結(jié)果得到純度較高的 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白（圖 3-1、圖 3-2、圖3-3），并于-80℃保存?zhèn)溆谩D3-2 SrfB

加入 5 倍柱體積的洗滌緩沖液洗脫蛋白，重復(fù)洗脫一次，加入 2 倍柱體 Elution buffer 洗脫，收集蛋白，重復(fù)洗脫三次，收集洗脫液，進(jìn)行 SDS-PAGE檢測。純化結(jié)果得到純度較高的 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白（圖 3-1、圖 3-2、圖3-3），并于-80℃保存?zhèn)溆�。圖3-2 SrfB蛋白電泳檢測Fig 3-2 SDS-PAGE of SrfB ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脫液圖3-3 SrfC蛋白電泳檢測Fig 3-3 SDS-PAGE of the SrfC ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脫液

碩士學(xué)位論文以檢測到明顯蛋白條帶，符合預(yù)計(jì) 113 kDa 的 SrfB 蛋白，SrfB，SrfA＋SrfB，SrfB＋SrfC，SrfA＋SrfB＋SrfC 與細(xì)胞孵育后的樣品在 100-150 kDa 之間均可以檢測到明顯蛋白條帶，符合預(yù)計(jì) 101 kDa 的 SrfC 蛋白。說明 SrfA，SrfB，SrfC 蛋白不論單獨(dú)還是混合與細(xì)胞孵育，都可較高效率地，主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞。A B

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本文編號(hào)：2770698