【摘要】：致病桿菌屬(Xenorhabdus sp.)是一類與斯氏線蟲(Steinernema sp.)互惠共生的昆蟲病原共生菌,能夠分泌多種殺蟲、抑菌和抗腫瘤的活性代謝產(chǎn)物,干擾宿主的免疫反應(yīng),導(dǎo)致昆蟲宿主死亡。課題組在前期研究中,通過對X.stockiae HN_xs01菌株進行Fosmid基因組文庫的構(gòu)建,從中篩選出復(fù)合毒素SrfABC,對昆蟲細胞和腫瘤細胞均具有明顯毒性,并且發(fā)現(xiàn)三組分蛋白之間具有相互作用。本文對SrfABC復(fù)合毒素各組分的活性及其作用機理進行了研究,為該類毒素在致病桿菌對昆蟲致病及抗腫瘤活性中的功能奠定了基礎(chǔ)。本研究利用GST標簽單獨表達載體在大腸桿菌中表達SrfA、SrfB、SrfC蛋白,通過生測實驗發(fā)現(xiàn)SrfA、SrfB、SrfC蛋白對棉鈴蟲均具有注射毒性,且三者混合時毒性最大。我們以樅色卷蛾中腸細胞系CF-203/2.5和人宮頸癌細胞系HeLa為作用靶標,利用倒置顯微鏡和MTT法發(fā)現(xiàn)SrfA、SrfB、SrfC蛋白均能導(dǎo)致腫瘤細胞和昆蟲細胞皺縮死亡,具有明顯細胞毒性,且三者混合作用時毒性最大。通過Hoechst/PI雙染和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)SrfA、SrfB、SrfC蛋白均能破壞CF-203/2.5細胞的細胞膜完整性,造成細胞凋亡,且三者混合作用時對細胞膜完整性破壞最大,凋亡率最高,并且三種蛋白均能將細胞周期阻滯在G2/M期。接下來,我們對SrfABC毒素各組分在細胞中的定位進行了研究。免疫熒光結(jié)果顯示:CF203細胞中,SrfA、SrfB、SrfC蛋白單獨或混合作用,均集中分布在細胞質(zhì);在HeLa細胞中,SrfA蛋白集中分布在細胞質(zhì),SrfB蛋白集中分布在細胞核,SrfC蛋白單獨作用時分布在細胞質(zhì),混合作用時從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核。通過Western blot驗證了SrfA、SrfB、SrfC蛋白單獨或混合作用,均能較高效率的、主動進入昆蟲細胞和腫瘤細胞。為了研究SrfABC毒素各組分的作用機制,我們將SrfA,SrfB,SrfC分別轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞HeLa和昆蟲細胞Sf9中。實驗表明:SrfA,SrfB,SrfC蛋白均在HeLa細胞中成功表達;利用免疫沉淀及質(zhì)譜技術(shù)篩選出其結(jié)合蛋白主要為骨架蛋白;Western Blot檢測顯示:SrfA蛋白轉(zhuǎn)染進HeLa細胞后,除了目的條帶外,還檢測到分子量大于SrfA蛋白的條帶,推測是SrfA蛋白在腫瘤細胞中的表達發(fā)生翻譯后修飾,通過定點突變和糖苷酶處理,初步排除了糖基化修飾的可能性。本文探究了SrfABC毒素對人腫瘤細胞和昆蟲細胞的細胞毒性,探明各組分的定位。初步分析了三元復(fù)合毒素的酶活性組分,初步研究了SrfABC類毒素在細胞內(nèi)發(fā)揮毒性的作用機理,為該類毒素在致病桿菌對病原微生物抵抗宿主防御、毒力發(fā)揮及宿主定殖中的研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q93
【圖文】：

碩士學(xué)位論文24圖3-1 SrfA蛋白電泳檢測Fig 3-1 SDS-PAGE of SrfA ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脫液第三章 結(jié)果和分析3.1 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白的純化將誘導(dǎo)表達后的三種蛋白質(zhì)上清用 0.22 μm 濾膜過濾，用 10 倍柱體積的清洗緩沖液清洗 GST 瓊脂糖樹脂，加入蛋白裂解液 5 mL，封閉底部，4℃結(jié)合 6 h，加入 5 倍柱體積的洗滌緩沖液洗脫蛋白，重復(fù)洗脫一次，加入 2 倍柱體 Elution buffer 洗脫，收集蛋白，重復(fù)洗脫三次，收集洗脫液，進行 SDS-PAGE檢測。純化結(jié)果得到純度較高的 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白（圖 3-1、圖 3-2、圖3-3），并于-80℃保存?zhèn)溆�。圖3-2 SrfB

加入 5 倍柱體積的洗滌緩沖液洗脫蛋白，重復(fù)洗脫一次，加入 2 倍柱體 Elution buffer 洗脫，收集蛋白，重復(fù)洗脫三次，收集洗脫液，進行 SDS-PAGE檢測。純化結(jié)果得到純度較高的 SrfA、SrfB、SrfC 蛋白（圖 3-1、圖 3-2、圖3-3），并于-80℃保存?zhèn)溆谩D3-2 SrfB蛋白電泳檢測Fig 3-2 SDS-PAGE of SrfB ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脫液圖3-3 SrfC蛋白電泳檢測Fig 3-3 SDS-PAGE of the SrfC ptoeinM:Marker; 1-3:Elution buffer洗脫液

碩士學(xué)位論文以檢測到明顯蛋白條帶，符合預(yù)計 113 kDa 的 SrfB 蛋白，SrfB，SrfA＋SrfB，SrfB＋SrfC，SrfA＋SrfB＋SrfC 與細胞孵育后的樣品在 100-150 kDa 之間均可以檢測到明顯蛋白條帶，符合預(yù)計 101 kDa 的 SrfC 蛋白。說明 SrfA，SrfB，SrfC 蛋白不論單獨還是混合與細胞孵育，都可較高效率地，主動進入細胞。A B

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本文編號：2770698