【摘要】：果蠅的變態(tài)發(fā)育主要由保幼激素(juvenile hormone,JH)和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)協(xié)同調(diào)控,Kr-h1基因作為保幼激素的初級反應基因,在保幼激素信號傳遞中發(fā)揮至關重要的作用。而miRNAs作為一種長約22 nt的非編碼小RNA,通過結合靶基因mRNA的特定位點,抑制mRNA翻譯或誘導降解,從而參與調(diào)控人類及動植物的生長發(fā)育和細胞凋亡等重要生理活動。因此,本研究以黑腹果蠅為試驗對象,研究在完全變態(tài)昆蟲中靶向作用于Kr-h1基因的miRNA,并證明miRNA對果蠅發(fā)育的影響,為生物學防治蚊蠅提供理論基礎和指導。本試驗首先通過多個生物信息學預測網(wǎng)站對靶向果蠅Kr-h1基因的miRNA進行預測,最終鎖定miR-927為可能靶向作用于Kr-h1基因的miRNA。接下來使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-927和Kr-h1基因之間的識別位點,結果顯示,miR-927 mimics和Kr-h1 3'UTR共轉(zhuǎn)染與對照組相比,雙熒光素比值(F/R)降低極顯著(P0.01),而Kr-h1 3'UTR單個位點突變的雙熒光素比值均顯著低于野生型載體(P0.05),兩個位點同時突變較野生型相比,則差異不顯著(P0.05)。結果表明,在Kr-h1基因的3'UTR上存在miR-927成熟序列特異性結合的位點,miR-927和Kr-h1基因存在靶標關系,Kr-h1基因能被miR-927特異性結合。為了探究miR-927與Kr-h1基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控關系,利用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測了在果蠅Kc細胞中將miR-927超表達后,Kr-h1基因的變化情況。qPCR結果顯示,miR-927 mimics轉(zhuǎn)染組較NC組相比,Kr-h1基因的表達量顯著降低(P0.05)。結合蟲體不同發(fā)育時期miR-927和Kr-h1基因的相對表達量,證明miR-927與Kr-h1在某些發(fā)育時期呈相互抑制關系。本研究分別在細胞水平和蟲體水平,研究了miR-927同JH之間的關系:使用保幼激素類似物Methoprene對果蠅Kc細胞及果蠅白色預蛹期進行不同時間梯度處理,檢測miR-927的表達差異。結果顯示,JH在細胞水平及蟲體上均能夠抑制miR-927的表達(P0.05)。然后將蟲體JH缺失,檢測miR-927的表達情況,結果顯示,JH缺失組miR-927的表達量較野生型相比顯著升高(P0.05)。結果證明,JH在一定程度上對miR-927起到抑制作用。為了更好的研究JH及miR-927對果蠅生長發(fā)育的調(diào)控,本實驗使用Methoprene處理白色預蛹期的果蠅腹部,觀察了背部剛毛的表型。結果發(fā)現(xiàn),Methoprene處理能夠?qū)е鹿壉巢縿偯霈F(xiàn)短剛毛、背部剛毛不能正常融合及出現(xiàn)斑塊等表型,且果蠅不能正常孵化成蟲。miR-927超表達蟲體則不能正常預蛹,一般發(fā)育至若蟲則不再發(fā)育,且蟲體發(fā)育緩慢,個體變小,極少數(shù)果蠅會變成“小蛹”,但未能孵化成蟲。結論:(1)dme-miR-927靶向作用于Kr-h1基因;(2)在果蠅Kc細胞及蟲體中,miR-927能夠?qū)r-h1基因進行轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,可以抑制Kr-h1基因mRNA的表達;(3)JH在細胞水平及蟲體水平均能夠抑制miR-927的表達;(4)JH及miR-927均對果蠅的生長發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q344
【圖文】：

ute 蛋白（Ago 蛋白）中后，兩條鏈中一條鏈（導向鏈 guid中，形成可發(fā)揮作用的 RNA 誘導沉默復合體（miRNA-inC），而另一條鏈（過客鏈 passenger strand）則會排出復合物前并無明確報道（圖 1-1[8]）。當然，在植物和動物中，mi：前體莖環(huán)結構及成熟過程。NAs 通過堿基互補配對與靶標 mRNA 的 UTR 區(qū)域（3'UTR對靶標 mRNA 剪切降解、抑制翻譯以及染色體重塑（甲基化補時，就會切割靶 mRNA，這種作用方式常見于植物中；當時，通常只會抑制翻譯而不影響 mRNA 的穩(wěn)定性，這種方式少見；當同時具有以上兩種作用模式時，稱為結合抑制。mi可在非編碼單元，又可在編碼單元；既可在內(nèi)含子區(qū)域，又iRNA 在基因組中和表達模式中成簇排列。

miR-9388 0.779658421 miR析r-h1 的 miRNA 結果進行匯總（圖 2-1）。由圖 2-1 可知，microT-CDS、TargetS 個，分別是 miR-8、miR-277、miR-92

合位點分析 Targetscan 網(wǎng)站預測對 miR-927 和 Kr-h1 基因向序列主要為：AUUCUAA 和 AUUCUAAA信息學分析最大的 miR-927 進行靶基因預測，得到 121 17 個參與生物學過程的靶基因（圖 2-2）。mi及生物調(diào)節(jié)過程。

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1 姚云;王博;蔣建茹;林欣大;;Met和Kr-h1基因在褐飛虱變態(tài)發(fā)育中的功能分析[J];昆蟲學報;2015年11期

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1 岳勇;楊瑞琳;王偉平;周琪皓;王進軍;豆威;;保幼激素信號通路基因Met及Kr-h1對橘小實蠅成蟲生殖的功能研究[A];綠色植保與鄉(xiāng)村振興——中國植物保護學會2018年學術年會論文集[C];2018年

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1 董文韜;果蠅Kr-h1表達調(diào)控相關miRNA的篩選及對變態(tài)發(fā)育影響的研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學;2019年

2 金敏娜;褐飛虱Kr-h1基因的克隆及其功能研究[D];中國計量學院;2013年

3 李亞麗;桔小實蠅保幼激素信號通路Met和Kr-h1基因功能初探[D];西南大學;2016年

本文編號：2768773