【摘要】：植物的生長起始于種子萌發(fā),受生長素和基因的共同調(diào)控。生長素是植物中最早被發(fā)現(xiàn)并研究的激素,它在植物細胞、組織和器官的分化、生長及植物與環(huán)境間的信息交流中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。根據(jù)生長素對基因表達的誘導或抑制的速度,被生長素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的基因可分為早期響應基因和晚期響應基因。生長素早期響應基因是生長素響應因子直接作用的一類基因,Small auxin-up RNA(SAUR)基因是已知的主要的早期基因之一,能夠被生長素誘導,其表達量能在很短的時間內(nèi)快速上調(diào),進而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。因此對OsSAUR10的表達和功能研究對于揭示生長素早期響應的調(diào)控機制具有重要的意義;同時對胚芽萌發(fā)時期的全基因組內(nèi)胚芽特異表達基因的篩選、鑒定和生信分析將有為進一步研究提供理論基礎(chǔ)。本實驗以水稻生長素早期響應基因OsSAUR10為研究對象,首先進行了基本的生物信息分析,研究了OsSAUR10的時空表達和亞細胞定位,同時通過農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得OsSAUR10的CRISPR和超表達植株以進一步研究OsSAUR10的功能,同時還系統(tǒng)的對水稻胚芽特異表達基因進行了生物信息學分析,所獲得的主要結(jié)果如下:1.水稻OsSAUR10編碼一個由166個氨基酸組成的蛋白質(zhì),不含信號肽,存在1個跨膜結(jié)構(gòu)域和3個CG島。表達分析表明該基因在花藥、幼穗、根和苗期的表達量較高,并且該基因的表達量在IAA、NOA、ABA、GA3誘導后顯著上調(diào)。說明OsSAUR10在水稻生長旺盛的部位表達。2.構(gòu)建35S::OsSAUR10:GFP載體,通過PEG4000轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體,并利用特異性的細胞膜染料Dil,將水稻原生質(zhì)體的細胞膜染為紅色,通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到GFP熒光與Dil熒光重合,說明OsSAUR10蛋白定位于細胞膜。3.構(gòu)建OsSAUR10超表達載體和CRISPR載體,并通過農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷的方法獲得轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明T_1代OsSAUR10過量表達轉(zhuǎn)基因植株苗期矮小、根系短。所獲得CRISPR突變類型為OsSAUR10起始密碼子后第192位到197位堿基缺失和第196位單堿基缺失兩種缺失突變。CRISPR家系種子的萌發(fā)率、結(jié)實率、分蘗數(shù)都降低,且在苗期矮小。說明OsSAUR10正向調(diào)控水稻種子萌發(fā)和苗期生長,且超表達家系和CRISPR家系在苗期的表型相同可能是由于響應不同的激素途徑導致的。4.進一步研究水稻中與生長素合成相關(guān)的OsYUCCA家族基因和與生長素極性運輸相關(guān)的OsPIN家族基因在超表達植株和CRISPR植株中的表達量。結(jié)果表明OsSAUR10抑制OsYUCCA家族和OsPIN家族基因的表達。5.通過對芯片數(shù)據(jù)的篩選,鑒定到了88胚芽特異表達基因(plumule-specific genes,OsPluS),45個OsPluS的僅在胚芽中高表達,9個OsPluS在所有組織中的表達量都較高。啟動子元件的分析顯示,在啟動子區(qū)域存在與胚發(fā)育,激素響應相關(guān)的順式元件,如-300 element,ABRELATERD1、ABADESI1、LTRECOREATCOR15、CAREOSREP1、GAREAT、WRKY71OS等。6.OsPluS的GO/KEGG富集分析表明,OsPluS可能參與脂肪酸生物合成過程,OsPluS互作蛋白的GO/KEGG富集分析的結(jié)果表明,OsPluS可能參與了生長素和脫落酸的合成。說明OsPluS與水稻胚芽發(fā)育過程中脂肪酸的合成相關(guān),并且可能通過激素響應調(diào)節(jié)水稻的胚芽發(fā)育。
【學位授予單位】：貴州師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S511;Q943.2
【圖文】：

第三章 結(jié)果與分析.1 OsSAUR10 的結(jié)構(gòu)分析為了研究OsSAUR10的結(jié)構(gòu)特征，我們對OsSAUR10的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)及結(jié)構(gòu)域進行了分析。OsSAUR10基因全長1451bp，cDNA全長501bp，不含子，且3′UTR含有SAUR家族所具有的DLS元件，經(jīng)SMART軟件分析發(fā)現(xiàn)sSAUR10在第12到第112位氨基酸之間含有Auxin inducible結(jié)構(gòu)域（圖1 AsSAUR10的二級結(jié)構(gòu)包含α螺旋和延伸鏈，但大多數(shù)結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲（圖1三級結(jié)構(gòu)也可以看出，OsSAUR10蛋白的三級結(jié)構(gòu)較為簡單，以無規(guī)則卷曲（圖1 C）。

secondary structure information; B, the location of the auxin response domain in OsSAUR10; C, The tertiarystructure of the OsSAUR10 protein.3.2 OsSAUR10 在胚芽期、根和花藥等組織中高表達為了探索 OsSAUR10 的表達模式，我們分別取了水稻 ZH11 在萌發(fā)后的不同時期、苗期、抽穗期的根、葉、小穗以及花藥等組織進行 qRT-PCR（圖 2）。結(jié)果顯示 OsSAUR10 在苗期的表達具有周期性，基因在表達升高后馬上又會降解，說明 OsSAUR10 在胚芽期有關(guān)鍵的作用，在胚芽期、根、穗期和花藥中的表達量較高。GUS 染色的結(jié)果顯示 OsSAUR10 在根和根毛中表達。以上結(jié)果暗示 OsSAUR10 在分裂活動旺盛的組織中高表達，在這些時期可能會影響水稻的發(fā)育。

3.3 OsSAUR10 CRISPR 材料的構(gòu)建及表型分析為了通過基因編輯獲得 OsSAUR10 的敲除突變體進行功能研究，我們選取OsSAUR10 基因外顯子上的 AGAAGGAGCGGTTCGCGGTG 序列作為 gDNA，通過重疊 PCR 的方法構(gòu)建了 pCXUN 重組載體，轉(zhuǎn)化粳稻 ZH11。對 T0代材料進行陽檢，將發(fā)生編輯的材料進行加代培育。對 T0代的材料進行陽檢和基因型鑒定可知，通過 CRISPR-Cas9 編輯的 OsSAUR10 獲得了 2 種類型的突變，第 1種為 OsSAUR10 起始密碼子后第 196 位單堿基缺失，第 2 種為起始密碼子后第192 位到 197 位堿基缺失（圖 3）。從測序結(jié)果可知，CRISPR 產(chǎn)生的兩種編輯情況均為純合突變，將這兩個家系分別命名為 Cr10-6 和 Cr10-15 并選擇它們進行后續(xù)研究。

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