【摘要】：核孔膜作為一種孔徑均一和圓柱形孔形的微孔濾膜,已在各行業(yè)的精密過(guò)濾領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用,基于較小孔徑核孔膜(100-300 nm)的擠出法也用于控制脂質(zhì)體粒徑。由此,本文將基于核孔膜的擠出法用于誘導(dǎo)脂質(zhì)體或脂質(zhì)囊泡膜融合。首先研究了擠出法能否誘導(dǎo)熒光標(biāo)記脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體膜融合,繼而研究了擠出法能否誘導(dǎo)熒光標(biāo)記脂質(zhì)體和外泌體發(fā)生膜融合。此外,基于物理性細(xì)胞內(nèi)遞送技術(shù)的原理和研究進(jìn)展,推測(cè)較大孔徑附核孔膜(7-11 μm)可用于細(xì)胞內(nèi)遞送。分別利用擠出法將熒光標(biāo)記的右旋糖酐大分子遞送至小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26和人髓性白血病細(xì)胞株K562，并對(duì)影響遞送效率的主要因素進(jìn)行了初步考察,此外還對(duì)不同分子量右旋糖酐是否進(jìn)入細(xì)胞核、入核途徑及時(shí)機(jī)進(jìn)行了研究。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1)擠出法誘導(dǎo)脂質(zhì)體膜融合制備了空白脂質(zhì)體和含F(xiàn)RET熒光分子對(duì)的標(biāo)記脂質(zhì)體,通過(guò)擠出法誘導(dǎo)脂質(zhì)體發(fā)生膜融合,動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)檢測(cè)脂質(zhì)體粒徑,激光共聚焦(CLSM)觀察脂質(zhì)體膜融合現(xiàn)象,熒光分光光度計(jì)定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化并計(jì)算膜融合率,以凍融法作為對(duì)照;并考察了擠出次數(shù)、壓力和溫度等對(duì)膜融合效率的影響。結(jié)果顯示,擠出法能誘導(dǎo)兩種脂質(zhì)體發(fā)生高效膜融合,這可從處理后的脂質(zhì)體共聚焦照片中熒光強(qiáng)度的變化證實(shí),此外對(duì)熒光強(qiáng)度變化的定量分析顯示擠出75次時(shí)膜融合效率達(dá)27%。與凍融法相比,擠出法的膜融合效率相當(dāng),但是所制得的膜融合脂質(zhì)體粒徑分布更均一。此外,低擠出壓力、生理溫度和高擠出次數(shù)有利于促進(jìn)膜融合和脂質(zhì)混合。2)擠出法構(gòu)建雜化外泌體從K562上清利用超速離心法提取外泌體,然后與熒光標(biāo)記脂質(zhì)體混合后擠出處理誘導(dǎo)膜融合,構(gòu)建雜化外泌體,并與凍融法進(jìn)行對(duì)照。利用透射電鏡對(duì)外泌體和雜化外泌體進(jìn)行觀察和鑒定,CLSM觀察熒光標(biāo)記脂質(zhì)體和外泌體的膜融合現(xiàn)象,DLS檢測(cè)各種脂質(zhì)囊泡粒徑,利用熒光分光光度法檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化并計(jì)算膜融合效率。結(jié)果顯示,擠出法能誘導(dǎo)脂質(zhì)體和外泌體膜融合,從而構(gòu)建雜化外泌體。透射電鏡下,雜化外泌體仍然保持了外泌體典型的茶托樣結(jié)構(gòu)。CLSM觀察證實(shí)二者發(fā)生了膜融合。與凍融法相比,擠出法(100次)的膜融合效率也即脂質(zhì)稀釋率稍低,但是擠出法制備的雜化外泌體具有均一的粒徑,且擠出過(guò)程耗時(shí)短。3)利用擠出法將右旋糖酐遞送入CT26細(xì)胞利用擠出法誘導(dǎo)CT26細(xì)胞變形及短暫膜穿孔而將不同分子量右旋糖酐遞送入細(xì)胞內(nèi),觀察了擠出對(duì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和增殖的影響,采用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析遞送效率和細(xì)胞死亡率,并考察了核孔膜孔徑和右旋糖酐分子量對(duì)遞送效率的影響。CLSM觀察了細(xì)胞內(nèi)右旋糖酐的亞細(xì)胞分布,也即質(zhì)核比。結(jié)果表明,擠出法處理的細(xì)胞保持了 CT26的貼壁生長(zhǎng)和增殖能力。核孔膜孔徑和右旋糖酐分子量影響了細(xì)胞內(nèi)遞送效率,孔徑和分子量與遞送效率負(fù)相關(guān)。3種不同分子量右旋糖酐在擠出處理后都能進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)入細(xì)胞核的量與分子量呈負(fù)相關(guān)。4)利用擠出法將右旋糖酐遞送入懸浮細(xì)胞K562利用擠出法誘導(dǎo)K562細(xì)胞變形及短暫膜穿孔而將不同分子量右旋糖酐遞送入細(xì)胞內(nèi),觀察了擠出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響,FACS分析遞送效率,并考察了核孔膜孔徑和右旋糖酐分子量對(duì)遞送效率的影響。CLSM觀察了細(xì)胞內(nèi)右旋糖酐的分布,也即質(zhì)核比,以確定2 MDa右旋糖酐細(xì)胞核的途徑和時(shí)機(jī)。結(jié)果表明,擠出法不影響K562細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。核孔膜孔徑和遞送材料分子量是影響遞送效率的重要因素,孔徑越小,則遞送效率越高,同時(shí)孔徑越小,則細(xì)胞的死亡率也越高。2 MDa右旋糖酐通過(guò)擠出誘導(dǎo)的核膜破裂進(jìn)入細(xì)胞核,并在核膜修復(fù)后保持了質(zhì)核比的穩(wěn)定。總之,基于核孔膜的擠出法可用于誘導(dǎo)脂質(zhì)囊泡的膜融合并用于構(gòu)建雜化外泌體,有望成為新的外泌體修飾方法;此外,基于核孔膜的擠出法可用于遞送各種大分子至貼壁細(xì)胞CT26和懸浮細(xì)胞K562,有望成為新的物理性細(xì)胞內(nèi)遞送方法。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q25
【圖文】：

柱狀損傷區(qū)域，直徑約１０邋ｎｍ，這些損傷區(qū)域稱作離子的潛徑跡，潛徑跡經(jīng)過(guò)化學(xué)逡逑蝕刻處理可形成中空通道（孔），即為核孔膜［１］。相比于常規(guī)濾膜，核孔膜擁有眾多逡逑優(yōu)點(diǎn)，如表面平整光滑、孔徑均一、圓柱形孔形（圖１－１），此外還具有機(jī)械強(qiáng)度高、逡逑過(guò)濾速度快和截留特性好等優(yōu)點(diǎn)。逡逑核孔膜的生產(chǎn)工藝主要包括輻照、紫外敏化和蝕刻等三個(gè)主要步驟。輻照一般逡逑利用加速器或者反應(yīng)堆進(jìn)行，目前主要都采用加速器進(jìn)行輻照。紫外敏化主要是改逡逑善核孔膜的孔形，讓錐度更小、透氣率更高、孔徑更均勻�；瘜W(xué)蝕刻則決定核孔膜逡逑最終孔徑大小。逡逑｜§邋廔ｉ逡逑（Ａ：核孔膜；Ｂ：普通濾膜）逡逑圖１－１核孔膜與普通濾膜比較逡逑基于核孔膜的特點(diǎn)，其應(yīng)用已相當(dāng)廣泛［２］。目前，很多微生物檢測(cè)、癌細(xì)胞的逡逑檢測(cè)以及氣體的檢測(cè)都需要用到核孔膜截留取樣。在制藥工業(yè)，核孔膜主要用于藥逡逑用水的過(guò)濾及終端除菌過(guò)濾，血液制品的過(guò)濾，空氣與蒸汽的過(guò)濾等。在食品飲料逡逑行業(yè)，核孔膜用于酒類、飲用水、奶制品、茶飲料等的澄清和除菌過(guò)濾，可代替離逡逑心法用于分離，或代替熱處理法用于除菌。在電子工業(yè)，可用于制備光刻膠及環(huán)境逡逑氣體凈化

括各種活性酶［６］。此外，外泌體還包含一系列寡核苷酸，尤其是線粒體ＤＮＡ、信使逡逑ＲＮＡ邋（ｍＲＮＡ）、微�。遥危铃澹ǎ恚椋遥危粒┮约霸S多其他非核苷酸編碼ＲＮＡ序列［７］。逡逑外泌體可從所有細(xì)胞類型分泌（圖１－２），用作細(xì)胞間的通訊載體，并通過(guò)各種逡逑方式與靶細(xì)胞相互作用。外泌體在炎癥、穩(wěn)態(tài)、凝血和鈣化等正常生理過(guò)程中起著逡逑重要作用，也與各種病理過(guò)程密切相關(guān)，特別是自身免疫性疾病和癌癥［８］。這導(dǎo)致逡逑了兩個(gè)新興研究領(lǐng)域的出現(xiàn)：將病理性外泌體作為診斷性生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，逡逑以及將包載各種藥物或大分子的外泌體用于疾病的治療［９］。逡逑圖１－２邋細(xì)胞分泌外泌體的示意圖逡逑為了將外泌體用于疾病的治療，前提條件是利用各種技術(shù)對(duì)外泌體進(jìn)行修飾，逡逑包括對(duì)外泌體膜的修飾及將各種藥物或大分子包載入外泌體。下面就對(duì)外泌體的各逡逑種修飾技術(shù)分別進(jìn)行介紹。逡逑１．２．１共價(jià)偶聯(lián)用于修飾外泌體膜逡逑外泌體在表面改性方面比細(xì)胞有一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)，即它們不具有細(xì)胞活性。因逡逑此，可以使用不適于活細(xì)胞膜功能化的試劑和反應(yīng)條件。不過(guò)，也有一些限制條件逡逑需要考慮。例如，過(guò)高的溫度、壓力或溶劑會(huì)導(dǎo)致表面蛋白質(zhì)變性，同時(shí)過(guò)高或過(guò)逡逑２逡逑

泌體表面進(jìn)行了連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)。首先，碳二亞胺偶聯(lián)用于將含炔的４－戊炔酸連到逡逑到外泌體膜胺基上。引入反應(yīng)性炔基允許與疊氮化物標(biāo)記的熒光團(tuán)進(jìn)行第二次點(diǎn)擊逡逑化學(xué)反應(yīng)（圖１－３）。胺是在生物膜上天然表達(dá)的反應(yīng)性官能團(tuán)，因此是直接且合理逡逑的目標(biāo)。然而，這種生物偶聯(lián)方式可能因改變或隱藏表面蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)而損害逡逑其功能。逡逑■－豪評(píng)逡逑ｆｅ／ｔ）邋Ｌｉｐｉｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邐－５邋Ｐｒｏｉｃｉｎ邋＊邋Ａｌｋｙｎｃ邐Ｎ３邋Ａｚｉｄｅ－Ｆｌｕｏｒ邋５４５逡逑圖１－３利用末端炔基修飾外泌體膜表面胺基［１（）］逡逑１．２．２代謝標(biāo)記法修飾外泌體逡逑代謝標(biāo)記也是一種完善的細(xì)胞功能化策略，該方法將非天然代謝物（例如氨基逡逑酸、脂質(zhì)、寡核苷酸或聚糖）添加到細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生物合成。這些代謝物逡逑被細(xì)胞吸收并分別整合到蛋白質(zhì)組、脂質(zhì)組、基因組和糖類中。盡管細(xì)胞功能化策逡逑略通常僅需要修飾細(xì)胞膜上的特定組分，但是代謝標(biāo)記是一種不可控的技術(shù)，可以逡逑修飾整個(gè)細(xì)胞不同亞細(xì)胞分布的各類生物分子。因此，預(yù)期外泌體和微囊泡等都會(huì)逡逑包含有代謝標(biāo)記的位點(diǎn)，例如內(nèi)體蛋白或細(xì)胞膜脂質(zhì)。Ｗａｎｇ等最近使用非天然氨逡逑基酸Ｌ－疊氮基高聚丙氨酸作為甲硫氨酸替代物將疊氮基團(tuán)引入黑色素瘤細(xì)胞外泌逡逑體的蛋白質(zhì)組［１１］。逡逑代謝細(xì)胞標(biāo)記已廣泛用于賦予細(xì)胞稀有或非天然的官能團(tuán)，如疊氮化物、炔烴、逡逑硫醇、甲基丙烯�；屯�。這些官能團(tuán)具有反應(yīng)活性，可以在細(xì)胞表面進(jìn)行修飾，逡逑而使用生物正交化學(xué)偶聯(lián)很少或幾乎沒(méi)有副反應(yīng)。這種方法已用于藥物與修飾后的逡逑細(xì)胞偶聯(lián)、選擇性殺傷細(xì)胞和表面凝膠化誘導(dǎo)等。迄今為止

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本文編號(hào)：2765992