【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類存在于骨髓基質(zhì)內(nèi)的多能干細胞。BMSCs因易分離且含量豐富,已成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域比較理想的種子細胞。馬在運動競技過程中常發(fā)生軟骨或骨損傷,采用BMSCs對其軟骨和骨修復(fù)的細胞治療已應(yīng)用于臨床多年,但對BMSCs在體內(nèi)、體外向軟骨細胞分化的調(diào)控機制尚不清晰。長非編碼RNA(lncRNA)是長度200nt的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物,可在多種細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究證實,lncRNA可通過調(diào)節(jié)其靶基因進而影響軟骨細胞分化和功能的發(fā)揮,但其詳細調(diào)控機制的研究鮮有報道。鑒于此,本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),篩選馬BMSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)分化過程中差異表達的lncRNA及其作用的靶基因,并初步建立參與軟骨形成相關(guān)的lncRNA與其靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),揭示調(diào)節(jié)BMSCs向軟骨細胞分化的分子調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:1.體外建立了馬BMSCs細胞系,檢測BMSCs表達了干細胞標記因子Sox2及間充質(zhì)干細胞表面標志因子CD44、CD90、CD105和整合素CD29。2.對分離純化的BMSCs進行成軟骨細胞的誘導(dǎo)分化,經(jīng)14 d、21 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后BMSCs成功分化為軟骨細胞。分化細胞呈現(xiàn)了軟骨細胞特有的形態(tài),并表達了軟骨細胞特異標記基因aggrecan、collagenⅡ和9。3.對BMSCs和由其分化而來的軟骨細胞分別進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序,所獲數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)相關(guān)軟件分析,共鑒定出3592個lncRNA;BMSCs與分化軟骨細胞之間差異表達lncRNA365個。篩選出多個參與調(diào)控馬軟骨細胞發(fā)育的潛在候選因子,如 lnc-cpm、lnc-traf3、lnc-22173、lnc-acvr2a、lnc-pde4d,其互作的靶基因分別為:MDM2、TRAF3、USP25、ACVR2A、PDE4d。經(jīng)熒光定量 PCR 檢測,BMSCs 和分化軟骨細胞中這些差異lncRNA和mRNA的表達趨勢與測序結(jié)果一致。4.經(jīng)GO和KEGG分析,構(gòu)建了差異表達的lncRNA與mRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)這些靶標mRNA主要富集于Wnt信號通路、p53信號通路MAPK及NF-kb信號通路中,這些基因通過控制軟骨細胞增殖、分化、凋亡,阻止破骨細胞生成,進而維持軟骨細胞發(fā)育。其中Wnt信號通路的Wnt5a、Wntll、plcdl基因,MAPK信號通路的 MAPK20、MAP2K、MAPK7/8,P53 通路的 MDM2、Bcl-2、WAF1、SIRT1、NRF2基因及其lncRNA與軟骨細胞的分化密切相關(guān)。以上研究結(jié)果為后續(xù)進一步揭示軟骨細胞分化過程中l(wèi)ncRNAs與靶基因的互作機制奠定了必要的前期基礎(chǔ),為BMSCs用于軟骨修復(fù)的細胞治療提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q25
【圖文】：

圖１邋ＩｎｃＲＮＡ作用機制逡逑Ｆｉｇ．邋１邋ＩｎｃＲＮ八邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｏｎ逡逑注：Ｉ：作為信號分子，ＩｎｃＲＮＡ指導(dǎo)基因在空間和時間的表達

圖２邋ＢＭＳＣｓ細胞表面標志物和干細胞轉(zhuǎn)錄因子的鑒定逡逑

圖３邋ＢＭＳＣｓ成軟骨誘導(dǎo)（１００邋Ｘ）逡逑Ｆｉｇ．３邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｃａｒｔｉｌａｇｅ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋（１００Ｘ）逡逑注：Ａ圖為對照組細胞；Ｂ圖為誘導(dǎo)培養(yǎng)７ｄ邋；邋Ｃ圖為誘導(dǎo)培養(yǎng)１２ｄ邋；邋Ｄ圖為誘導(dǎo)培養(yǎng)１７ｄ

【參考文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王偉;線粒體肌病非編碼RNA表達譜研究及潛在分子標志物篩選[D];山東大學(xué);2017年

本文編號：2763870