發(fā)布時(shí)間：2020-07-19 18:55

【摘要】：氣候變化正在加劇全球干旱,嚴(yán)重威脅著糧食安全。由于植物是著地固定生長(zhǎng),不能主動(dòng)逃避環(huán)境危害,為了生存植物進(jìn)化出復(fù)雜且精細(xì)的調(diào)控機(jī)制來(lái)減少干旱危害。因此解析植物的抗旱分子機(jī)制對(duì)于培育新的抗旱品種有重要的指導(dǎo)意義。組蛋白的修飾是生物表觀遺傳調(diào)控的一種重要方式,組蛋白的修飾改變了染色質(zhì)的構(gòu)型,進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中的一個(gè)組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)去甲基化酶,JMJ17,在干旱脅迫和脫落酸(ABA)應(yīng)答途徑中行使重要功能。本研究分析了組蛋白的去甲基化在干旱脅迫和ABA應(yīng)答中的作用,闡明了H3K4去甲基化酶JMJ17調(diào)控干旱脅迫和ABA應(yīng)答的分子機(jī)制。本研究利用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物信息分析等方法,系統(tǒng)地分析了組蛋白去甲基化酶JMJ17在干旱脅迫和ABA應(yīng)答過(guò)程中的調(diào)控作用。主要的研究結(jié)果如下:(1)利用亞細(xì)胞定位和時(shí)空特異性表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)JMJ17定位于細(xì)胞核,并在擬南芥的根、胚軸、花等部位均有表達(dá)。(2)與野生型相比,jmj17突變體表現(xiàn)出抗旱表型和對(duì)ABA敏感表型。(3)利用體內(nèi)、體外酶活實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)JMJ17有組蛋白去甲基化酶的活性,能夠有效地降低H3K4me1/2/3水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn),JmjC中與亞鐵離子結(jié)合的保守氨基酸對(duì)JMJ17的去甲基化酶活性是必需的。保守氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變的回補(bǔ)系材料(JMJ17[H79A/E81A]),其葉片失水率以及干旱后存活率均與jmj17-1突變體相近,說(shuō)明JMJ17的去甲基化作用對(duì)植物干旱脅迫應(yīng)答是必需的。(4)jmj17-1單突變體與野生型的表型無(wú)顯著差異,而jmj17-1 jmj14-1 jmj16-1三突變體表現(xiàn)出更大的蓮座葉以及更早的開(kāi)花表型,說(shuō)明JMJ17與JMJ14、JMJ16可能在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中存在著功能冗余。(5)利用ChIP-seq和RNA-seq分析,發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫后,與野生型相比,jmj17突變體中部分脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄水平與H3K4me3水平均顯著上升,說(shuō)明在干旱脅迫下JMJ17能影響H3K4me3水平同時(shí)還影響基因的表達(dá)。(6)我們構(gòu)建了jmj17-1 ost1-3雙突變體,發(fā)現(xiàn)雙突變體在干旱脅迫下表型與ost1-3表型一致,結(jié)合ChIP-qPCR分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫應(yīng)答過(guò)程中OST1在JMJ17的遺傳學(xué)下游行使功能。(7)我們構(gòu)建了jmj17-1 abi5-7雙突變體,發(fā)現(xiàn)在ABA介導(dǎo)的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)抑制過(guò)程中,雙突變體表現(xiàn)出與abi5-7突變體相似的ABA低敏表型,結(jié)合ChIP-qPCR的結(jié)果表明:在ABA介導(dǎo)的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)抑制過(guò)程中,JMJ17調(diào)控ABI5位點(diǎn)的H3K4me3水平進(jìn)而影響其表達(dá)。(8)利用免疫共沉淀、雙分子熒光互補(bǔ)等實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)JMJ17在體內(nèi)與WRKY40互作;對(duì)ABA處理后的材料進(jìn)行RNA-seq分析,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,jmj17和wrky40突變體中的差異表達(dá)基因有顯著的重疊,同時(shí)在含有ABA的培養(yǎng)基上,雙突變體和各單突變體的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)表型相近,暗示JMJ17和WRKY40在同一條途徑中調(diào)控ABA應(yīng)答。綜上所述,本研究結(jié)果表明組蛋白去甲基化酶JMJ17,通過(guò)調(diào)控OST1,ABI5等脅迫應(yīng)答基因的H3K4me3水平影響這些基因的表達(dá),在干旱脅迫和ABA應(yīng)答途徑中行使負(fù)調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q945.78
【圖文】：

圖 1-2ABA 誘導(dǎo)氣孔閉合模型[23]Figure 1-2 Model ofABA-induced stomatal closure[23]示，氣孔開(kāi)放因子（Stomatalopeningfactor，OST1酶，又被稱為 SnRK2.6（sucrosenonfermenting-1（）。OST1 能影響 ABA 誘導(dǎo)氣孔閉合的速度，同時(shí)調(diào)控的作用[24,25]。在植物遭受干旱脅迫后，保衛(wèi)細(xì) PP2C 對(duì) OST1 的抑制作用，活化的 OST1 會(huì)磷酸wanionchannel-associated1）是 OST1 的一個(gè)靶蛋陰離子通道蛋白。SLAC1 的磷酸化能導(dǎo)致其激活外流（Cl-/NO3-），引起鉀離子的釋放。另一個(gè)已知通道 KAT1（K+inward rectifying channels in A. tha KAT1 抑制其活性，這樣阻止了 K+內(nèi)流。OSTrespiratoryburstoxidasehomolog，RBOH）使其激gen species，ROS）的產(chǎn)生[25]。ROS 在 ABA 信號(hào)以激活質(zhì)膜和液泡膜上的 Ca2+通道，使 Ca2+釋放到

21圖 3-1 JMJ17 在干旱脅迫應(yīng)答過(guò)程中的負(fù)調(diào)控作用Figure 3-1 JMJ17 plays negative roles in dehydration stress responses（A）JMJ17 基因示意圖。外顯子和內(nèi)含子分別用黑色實(shí)框和黑線表示，三角形表示 T-DNA插入位置。（B）JMJ17 轉(zhuǎn)錄本的 RT-PCR 分析。利用特異引物進(jìn)行半定量 RT-PCR 分析，18SrRNA 作為內(nèi)參對(duì)照。（C）和（D）離體葉片失水速率的測(cè)量。取各基因型植株的地上部分放在相對(duì)濕度 30%的條件下，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行稱重。（C）失水 3h 的表型，標(biāo)尺為 2cm；（D）失水率的統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)為實(shí)驗(yàn)平均值±SD，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。（E）和（F）干旱后存活率的測(cè)量。將土中生長(zhǎng) 14 天植株干旱處理 14 天，復(fù)水 3 天后檢測(cè)存活率。（E）干旱后植物的表型圖片；（F）復(fù)水 3 天后植株存活率的統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)為實(shí)驗(yàn)平均值±SD，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 5 次，**代表 P < 0.01，t 檢驗(yàn)。隨后我們利用 CRISPR/Cas9 方法得到了另兩個(gè)突變體：jmj17-3 和 jmj17-4。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)載體來(lái)自劉耀光老師的惠贈(zèng)，Cas9 是由 YAO 基因（特異地在

胚囊、胚、胚乳和花粉中表達(dá)）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)[92]。利用 Sanger 測(cè)序方法，我們篩選到 jmj17-3 和 jmj17-4 的純和突變體。jmj17-3 中在 ATG 下游 543bp 處有一個(gè)堿基的增加，導(dǎo)致了移碼突變，最終在 JmjC 結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生了終止密碼子（終止密碼子在 556-bp 到 558-bp）（圖 3-2A 和附表 2）。同樣在 jmj17-4 中，在 ATG 下游的 580 bp 處有一個(gè)堿基的缺失，導(dǎo)致了 646~648 bp 處提前形成終止密碼子。為了排除 Cas9 基因的影響，我們通過(guò)篩選不抗潮霉素的植株，得到了不含 Cas9的 jmj17-3 和 jmj17-4 的純和突變體（圖 3-2 B）。我們發(fā)現(xiàn) jmj17-3 和 jmj17-4 葉片失水速率慢于野生型。隨后我們將 jmj17-3 或 jmj17-4 與 jmj17-1 雜交得到 F1代，[jmj17-1 x jmj17-3 (F1)或 jmj17-1 x jmj17-4 (F1)]，發(fā)現(xiàn) F1 代的土中干旱存活率與 jmj17-3 和 jmj17-4 相似，即存活率明顯高于野生型（圖 3-2C,D）。說(shuō)明 jmj17-3 和 jmj17-4 與 jmj17-1 是在同一基因發(fā)生的突變，JMJ17 缺失突變的擬南芥抗旱性顯著提高。

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