發(fā)布時間：2020-07-19 18:50

【摘要】：非編碼RNA在各種生命過程中扮演著極其重要的角色,特別是microRNA(miRNA)一直是生命科學(xué)的熱點研究領(lǐng)域。miRNA能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)對維持生物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵的作用。眾所周知免疫響應(yīng)的過度激活或不足都會造成生物體不同程度的損傷甚至導(dǎo)致疾病,因此,深入研究miRNA在動物免疫穩(wěn)態(tài)維持中的功能和調(diào)控機(jī)制具有重要的理論和實踐意義。黑腹果蠅因其具有易飼養(yǎng)、生長周期短、雌雄易辨、完整的全基因組序列、以及遺傳資源豐富等特點,已成為研究動物免疫功能和免疫響應(yīng)機(jī)制的重要模式生物。果蠅先天免疫主要是通過激活Toll信號通路與Imd信號通路產(chǎn)生抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)來抵抗外界病原微生物的侵染,而果蠅Toll信號通路和Imd信號通路也分別與哺乳生物中的TLR通路和TNF-α信號通路同源,它們在免疫響應(yīng)調(diào)控中具有相同的進(jìn)化起源。因此,深入研究miRNA在果蠅Toll和Imd信號通路中的調(diào)控機(jī)制,不僅對清晰地闡明miRNA在果蠅免疫穩(wěn)態(tài)中的功能與作用機(jī)制具有重要的意義,而且也能為進(jìn)一步揭示miRNA在昆蟲先天免疫以及人類先天免疫中的調(diào)控作用機(jī)制提供重要的啟示。為此,本論文圍繞miRNA如何調(diào)控果蠅Toll信號免疫響應(yīng)這一科學(xué)問題,開展了一系列的研究,獲得了以下的主要結(jié)果:1.利用實時熒光定量(qRT-PCR)對革蘭氏陽性菌藤黃微球菌(Micrococcus luteus,M.luteus)感染高表達(dá)miR-975/976/977果蠅后6個時間點的抗菌肽(Drosomycin,Drs)基因的表達(dá)進(jìn)行了定量分析,發(fā)現(xiàn)感染后24h與48h的miR-975/976/977高表達(dá)果蠅的Drs顯著下調(diào);同時利用qRT-PCR方法進(jìn)一步檢測了基因缺陷型miR-975/976/977 KO果蠅Drs表達(dá)在12h、24h、48h呈顯著上調(diào),這些結(jié)果揭示miR-975/976/977能夠負(fù)調(diào)控果蠅Toll信號免疫響應(yīng)。2.為確定miR-975/976/977這一簇中是哪一種或哪幾種miRNA調(diào)控果蠅Drs表達(dá),我們進(jìn)一步利用qRT-PCR分別檢測了miR-975、miR-976、miR-977高表達(dá)果蠅感染后6個時間點體內(nèi)Drs表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有miR-977與miR-975/976/977簇結(jié)果一致,都能夠負(fù)調(diào)控果蠅Drs的表達(dá)。3.為了進(jìn)一步揭示miR-977負(fù)調(diào)控Toll信號響應(yīng)的機(jī)制,我們利用miRanda與TargetScan的程序?qū)iR-977可能調(diào)控的靶基因進(jìn)行預(yù)測,取交集后發(fā)現(xiàn)miRNA-977能夠靶向果蠅Toll信號通路中的Toll、myd88和Dif。4.利用qRT-PCR檢測果蠅體內(nèi)Toll、myd88、Dif基因的表達(dá)水平,根據(jù)定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-977只能靶向Dif基因。5.基于miR-977的雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)miR-977免疫調(diào)控功能主要是通過靶向果蠅Toll信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子Dif的Dif-RA/RB/RD三個轉(zhuǎn)錄本來負(fù)調(diào)控Drs表達(dá)�？傊�,本文研究發(fā)現(xiàn)了miR-977是一種新的負(fù)調(diào)控因子參與果蠅Toll信號免疫響應(yīng)的負(fù)調(diào)控,并且揭示了miR-977是通過調(diào)控Dif-RA/RB/RD三個轉(zhuǎn)錄本的表達(dá),從而負(fù)調(diào)控果蠅Toll免疫響應(yīng);同時本文的研究也闡明了miRNA在革蘭氏陽性細(xì)菌感染果蠅Toll介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q352
【圖文】：

ath domains 的 MyD88 蛋白，MyD88 蛋白上的 Death domains 招募 TuPelle 蛋白，這兩種蛋白的也含有 Death domians 結(jié)構(gòu)域。Pelle 蛋白上蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，可以將哺乳動物同源的 IkB 蛋白 Cactus 磷酸化，錄因子 Dif 和 Dorsal 的結(jié)合，將 Dif 和 Dorsal 的 NLS（核定位信號。使這兩種轉(zhuǎn)錄因子入核，啟動下游抗菌肽的轉(zhuǎn)錄（如圖 1.1 所示

31.2.1.2Imd 信號通路目前研究揭示，Imd信號通路與哺乳動物的TNFR通路高度同源（如圖1.2所示）。圖 1.2 果蠅 Imd 信號通路（左）與人類 TNFR 信號通路（右）[19]Figure 1.2 Imd pathway in Drosophila and TNFR pathway in human.果蠅的Imd通路主要是對革蘭氏陰性（G-）菌起作用。在G-菌侵染下，果蠅模式識別蛋白(PGRP-LC) 識別并結(jié)合G-菌表面的二氨基庚二酸肽聚糖（DAP-PGN），形成一個由Imd組成的信號復(fù)合體，激活I(lǐng)md 接頭蛋白。其中Imd是含有死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與哺乳動物RIP1 同源，Dredd 是哺乳動物caspase-8的同源蛋白。[20-23]。Imd通路激活，Iap2、UEV1、Ubc13、Ubc5一起通過泛素化激活Dredd，活化后的Dredd會對Imd 進(jìn)行剪切，去除30 個氨基酸的 N 末端片段

的雙鏈 miRNA 中過客鏈剪切掉，另一條引導(dǎo)鏈被保成了成熟 miRNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（miRISC）[71, 72]。內(nèi)切酶活性的 AGO1、AGO3、AGO4 蛋白通過結(jié)合形成了具有特定功能性的 miRISC,而被剪切的過客鏈解（如圖 1.3 所示）[73]。

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本文編號：2762819