【摘要】：桿狀病毒是一類大的環(huán)狀DNA病毒,能特異性感染無(wú)脊椎動(dòng)物。桿狀病毒有兩種存在形式:出芽型病毒粒子(Budded Virus,BV)和包埋型病毒粒子(Occlusion-Derived Virus,ODV),分別介導(dǎo)系統(tǒng)感染和口服感染。其中口服感染是由ODV囊膜上的口服感染因子介導(dǎo)的,目前在桿狀病毒中發(fā)現(xiàn)有10種口服感染因子,即PIF0~PIF9。部分口服感染因子可以形成穩(wěn)定的復(fù)合物,該復(fù)合物有助于病毒入侵,但是PIF5并不參與復(fù)合物的形成,也不會(huì)影響該復(fù)合物的形成;在所發(fā)現(xiàn)的口服感染因子中,pif5轉(zhuǎn)錄水平最高,但是PIF5在口服感染過(guò)程中的作用仍然不清楚。為了研究PIF5對(duì)病毒粒子產(chǎn)生和感染的影響,本論文先研究研究苜蓿斜紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)PIF5對(duì)病毒粒子BV和ODV形成的影響。檢測(cè)pif5基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相和表達(dá)時(shí)相,結(jié)果顯示pif5是一個(gè)晚期基因;PIF5是ODV囊膜的特異蛋白,在病毒感染過(guò)程中定位于細(xì)胞核內(nèi)微囊泡和ODV囊膜上;通過(guò)同源重組和轉(zhuǎn)座構(gòu)建缺失型和回復(fù)型重組病毒,結(jié)果顯示缺失pif5并不會(huì)影響B(tài)V的產(chǎn)生和感染,也不影響ODV的形成和包埋、OB的形態(tài)及OB中ODV的數(shù)量,但是它影響ODV的口服感染能力及感染Sf9細(xì)胞的能力。為了研究PIF5在口服感染過(guò)程中的作用,我們對(duì)截短型PIF5蛋白進(jìn)行表達(dá)及純化。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶的PIF5-P-T1蛋白,純化時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白有多種存在形式:單體和多聚體;對(duì)該蛋白純化方法優(yōu)化后,蛋白單體比例增加;通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶表達(dá)的PIF5-E-T1蛋白,并篩選穩(wěn)定表達(dá)該蛋白的細(xì)胞系。同時(shí)從中腸中提取刷狀緣膜囊泡;通過(guò)far-western blot檢測(cè)到PIF5-P-T1和PIF5-E-T1蛋白與提取的中腸細(xì)胞刷狀緣膜囊泡(Brush broder membrane vesicle,BBMV)有相互作用;通過(guò)Pull-down及質(zhì)譜鑒定來(lái)尋找病毒入侵過(guò)程中與PIF5進(jìn)行作用的宿主蛋白。同時(shí)對(duì)外源表達(dá)的PIF5-P-T1蛋白與BBMV進(jìn)行共孵育,發(fā)現(xiàn)PIF5-P-T1蛋白的特異性剪切,推測(cè)BBMV可能促進(jìn)PIF5的剪切。本論文通過(guò)研究PIF5對(duì)BV產(chǎn)生和感染、ODV包埋及OB形態(tài)的影響,截短型PIF5蛋白的表達(dá)與純化,截短型PIF5蛋白與BBMV相互作用等,初步揭示了PIF5的功能,為研究口服感染因子介導(dǎo)桿狀病毒口服感染的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q939.4
【圖文】：

病毒是不同種；如果平均每個(gè)位點(diǎn)的替換數(shù)介于同種病毒的不同亞型（Jehle et al.，2006）。γ-屬 NPV，其中紅頭松樹(shù)葉蜂核型多角體病毒（Neovirus，NeleNPV），松黃葉蜂核型多角體病毒（Novirus，NeseNPV）和冷杉葉蜂核型多角體病毒（Novirus，NeabNPV）不編碼典型的膜融合蛋白（F-蛋在中腸中進(jìn)行復(fù)制（Arifetal.，2011）。δ-屬桿狀蚊核型多角體病毒（Culex nigripalpus nucleop該病毒有 BV 和 ODV 兩種形態(tài)，在感染后期形成包涵體呈球狀，但沒(méi)有同源的多角體蛋白或同源2006）。的結(jié)構(gòu)

桿狀病毒口服感染因子 PIF5 功能初步研究的病毒絕大部分是 SNPV。在病毒感染晚期，細(xì)胞核內(nèi)形成的 ODV 包埋進(jìn)多角體中形成 OB，在境下，多角體可以保護(hù) ODV 病毒（Rohrmann，2013）（圖 1.2）。多角體蛋白是多角體蛋白，多角體蛋白形成三聚體，三聚體通過(guò)二硫鍵進(jìn)一步形聚體，在高 pH 環(huán)境下，二硫鍵被破壞，OB 解聚（Rohrmann，2013；Jiet10）。多角體蛋白是桿狀病毒中最保守的蛋白之一，但是在 δ-桿狀病毒屬發(fā)現(xiàn)其同源蛋白。OB 表面是一層光滑的膜，稱為多角體膜，可以將病毒環(huán)境隔離，增強(qiáng)多角體的穩(wěn)定性，其組裝與多角體膜蛋白（PEP）和 P10 關(guān)（Patmanidi et al.，2003；Lee et al.，1996）。多角體膜與傳統(tǒng)意義上的脂層囊膜不同，該膜有多孔，在中腸堿性條件下可以讓陰離子快速通過(guò)，角體膜釋放 ODV，感染中腸細(xì)胞。

圖 1.3 桿狀病毒初始感染和二次感染（Blissard and Theilmann，2018）初始感染：OB 進(jìn)入中腸后堿解釋放 ODV，ODV 穿過(guò)圍食膜與中腸上皮細(xì)胞的微絨毛結(jié)合和膜融合；病毒進(jìn)入細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)制并組裝核衣殼，通過(guò)出芽的方式產(chǎn)生成熟的 BV。BV 通過(guò)血液循環(huán)或者直接感染其它細(xì)胞組織，在感染早期細(xì)胞產(chǎn)生 BV 而在感染晚期產(chǎn)生 ODV。最后 ODV 包埋形成 OB，細(xì)胞裂解及昆蟲(chóng)死亡液化。Figure 1.3 Baculovirus virion primary infection and secondary infection (Blissard anTheilmann，2018)Primary infection is that OBs are disassembled and release ODVs into midgut. ODVs biand fuse with microvilli of midgut epithelialcells aftertraversing peritrophic membrane (PMIn cells, viruses replicate and the assembled nucleocapsid bud to generate mature BVs. BVmay infect other cells directly or by circulating in hemolymph. The infected cells by BV

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本文編號(hào)：2760618