【摘要】：鼠李糖脂(Rhamnolipid)生物表面活性劑主要通過銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)發(fā)酵法生產(chǎn)獲得,但是銅綠假單胞菌較強的條件致病性限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。利用基因工程手段構(gòu)建一株相對安全且高效的鼠李糖脂生產(chǎn)菌株,是目前該領(lǐng)域研究的重點。本研究利用假單胞菌的重組酶系統(tǒng)敲除防御假單胞菌Pf-5(Pse-udomonas protegens Pf-5)的羥基脂肪酸合成編碼基因pha,從而消除鼠李糖脂合成的競爭性抑制作用,增加鼠李糖脂產(chǎn)量。與此同時,通過兩親本接合轉(zhuǎn)移的方法整合來源于P.aeruginosa PAO1的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhlAB)于Pf-5基因組中。本研究利用Red/ET DNA重組技術(shù)對實驗室已有的含鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體pBBR1-genta-RhlAB進(jìn)行修飾,將3種不同強度組成型啟動子(P_(apra)、P_(tac)和P_(rhaB))成功替換了P.aeruginosa PAO1中的P_(RhlAB)原始啟動子,構(gòu)建了表達(dá)載體pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,p-BBR1-kan-P_(tac)-RhlAB和pBBR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB,并將這些表達(dá)載體分別在P.protegens Pf-5中異源表達(dá),實現(xiàn)了不同產(chǎn)量的鼠李糖脂異源合成。在LB培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵至42 h時,Pf-5/pBBR1-genta-RhlA B的鼠李糖脂產(chǎn)量為17.56 mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂產(chǎn)量分別是11.135 mg/L,441.135 mg/L,557.764 mg/L,啟動子優(yōu)化后鼠李糖脂產(chǎn)量分別是原始啟動子的0.63,25.12和31.76倍。進(jìn)一步對工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化,以1%的葡萄糖為碳源的LB培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵至42 h時,工程菌Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,Pf-5/pB-BR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂產(chǎn)量分別為18.778 mg/L,38.859mg/L,375.742 mg/L,418.551 mg/L。在以橄欖油為碳源的LB培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵至42 h時,工程菌Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-genta-P_(apra)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,Pf-5/pBB-R1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂產(chǎn)量分別為30.208 mg/L,55.011 mg/L,937.887 mg/L,844.517 mg/L。以1%的橄欖油為碳源的PG培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵至42 h時,工程菌Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂產(chǎn)量分別為403.27 mg/L,522.034 mg/L。以1%的橄欖油為碳源的MSP培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵至42 h時,工程菌Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,Pf-5/pBBR1-kan-P_(rhaB)-RhlAB的鼠李糖脂產(chǎn)量分別為410.022 mg/L,586.079 mg/L。獲得了最優(yōu)生產(chǎn)鼠李糖脂工程菌Pf-5/pBBR1-kan-P_(tac)-RhlAB,鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到937.887 mg/L。對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析,共檢出相對含量變化的4類質(zhì)核比不同的鼠李糖脂同系物。并通過實時熒光定量PCR定量分析rhlAB基因,在P_(apra),P_(tac)和P_(rhaB)啟動子調(diào)控下,rhlAB基因的相對表達(dá)量分別是原始啟動子調(diào)控下的0.93,2.16和2.77倍。本研究首次在防御假單胞菌Pf-5中對rhlAB基因進(jìn)行了調(diào)控功能研究,利用定向遺傳改造的方法成功構(gòu)建了鼠李糖脂高產(chǎn)菌株,為實現(xiàn)鼠李糖脂rhlAB基因異源高效表達(dá)和合成調(diào)控奠定了相關(guān)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

重組載體 pBeloBAC11-oriT-TnpA-genta-RhlAB。將重組載體 pBeloBAC11-oriT-TnpA-genta-RhlAB 電轉(zhuǎn)入 ET12567 菌株用于接合轉(zhuǎn)移，鼠李糖脂基因 rhlAB 通過隨機轉(zhuǎn)座整合到 Pf-5/ pha 菌株的基因組上，最終獲得 Pf-5/ pha-rhlAB。2.5 同源重組構(gòu)建鼠李糖脂操縱子相關(guān)的表達(dá)載體2.5.1 構(gòu)建重組載體 pBBR1-genta-Papra-RhlAB以載體 p15A-cm-apra 為模版，以 Papra-RhlAB-5'/Papra-RhlAB-3'為引物，擴(kuò)增兩端帶有質(zhì)粒 pBBR1-genta-RhlAB 上 rhlAB 原始啟動子兩側(cè)同源臂的 apra+rbs（1011 bp）線性載體片段。將得到的 apra+rbs 線性片段與質(zhì)粒載體 pBBR1-genta-RhlAB 一起電轉(zhuǎn)入通過 L-阿拉伯糖誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的 E. coli GB05-red，在重組酶的作用下發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組，apra+rbs 線性片段與質(zhì)粒載體 pBBR1-genta-RhlAB 經(jīng)同源臂退火雜交結(jié)合成環(huán)狀，從而形成重組載體 pBBR1-genta-Papra-RhlAB，如圖 2-1。

從而形成重組載體 pBBR1-kan-Ptac-RhlAB,如圖2-2。圖 2-2 通過線環(huán)重組構(gòu)建質(zhì)粒 pBBR1-kan-Ptac-RhlABFigure 2-2 Constructions of pBBR1-kan-Ptac-RhlAB by LCHR2.5.3 構(gòu)建重組載體 pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB以載體 pBBR1-kan-PrhaB為模版，以引物 Rha-RhlAB-5'/Rha-RhlAB-3'擴(kuò)增兩端帶有質(zhì)粒 pBBR1-kan-Ptac-RhlAB 上 Ptac啟動子兩側(cè)同源臂的 kan+rhaS+rhaR+PrhaB（3321 bp）線性載體片段。將獲得的 kan+rhaS+rhaR+PrhaB線性片段與質(zhì)粒載體 pBBR1-kan-Ptac-RhlAB一起電轉(zhuǎn)入通過 L-阿拉伯糖誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的 E. coli GB05-red，在重組酶的作用下發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組，kan+rhaS+rhaR+PrhaB線性片段與質(zhì)粒載體 pBBR1-kan-Ptac-RhlAB 經(jīng)同源臂退火雜交結(jié)合成環(huán)狀，從而形成重組載體 pBBR1-kan-PrhaB-Rhl-AB，如圖 2-3。

圖 2-3 通過線環(huán)重組構(gòu)建質(zhì)粒 pBBR1-kan-PrhaB-RhlABFigure 2-3 Constructions of pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB by LCHR2.6 鼠李糖脂表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入防御假單胞菌 Pf-5將測序正確的重組質(zhì)粒 pBBR1-genta-RhlAB，pBBR1-genta-Papra-RhlAB，pBBR1-kan-Ptac-RhlAB，pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB 通過常溫電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入防御假單胞菌 Pf-5 中，圖 2-4 為本研究中構(gòu)建 Pf-5 重組工程菌流程圖。

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本文編號：2760477