【摘要】：醋酸發(fā)酵生產(chǎn)用醋酸菌菌種及其耐酸特性是制約高酸度醋生產(chǎn)的重要因素。而有效的分子克隆工具則是研究醋酸菌耐酸的關(guān)鍵。本文以巴氏醋桿菌Ab3為研究對(duì)象,主要從啟動(dòng)子的選擇、預(yù)測(cè)、及熒光蛋白報(bào)告基因的成功運(yùn)用等方面著重介紹了適合巴氏醋桿菌的表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程。本文選擇巴氏醋桿菌5個(gè)重要耐酸蛋白分別為乙醇脫氫酶(AdhA)、分子伴侶蛋白(DnaK,DnaJ,GrpE)、PqqA 以及 16srDNA為出發(fā)點(diǎn),借助BPROM軟件預(yù)測(cè)其基因上游啟動(dòng)子區(qū)。最后根據(jù)預(yù)測(cè)分值,選擇PadhA,PgrpE以及PdnaK為對(duì)象進(jìn)行后續(xù)研究。三種啟動(dòng)子大小皆為200 bp左右,以pBBR1MCS5抗性替換后得到的pBBRA為基礎(chǔ),成功構(gòu)建了連有三種不同啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒pBBRAP1,pBBRAP2 以及 pBBRAP3。本文在巴氏醋桿菌中首次并成功運(yùn)用熒光蛋白報(bào)告基因驗(yàn)證了所選啟動(dòng)子的活性。結(jié)果表明分別含有重組質(zhì)粒pBBRAPIGFP,pBBRAP2GFP以及pBBRAP3GFP的重組菌熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于對(duì)照菌株,證實(shí)所選啟動(dòng)子有效且可用于外源蛋白的表達(dá)。另外研究還表明啟動(dòng)子的活性與生長(zhǎng)周期以及環(huán)境壓力密切相關(guān),如啟動(dòng)子PadhA的活性在整個(gè)生長(zhǎng)周期均較高,而分子伴侶蛋白編碼基因啟動(dòng)子在生長(zhǎng)中后期活性較高。這與巴氏醋桿菌在生長(zhǎng)時(shí)面對(duì)醋酸壓力的情況下,蛋白表達(dá)情況變化類似,因此本文所開(kāi)發(fā)的基于GFP報(bào)告基因的表達(dá)體系,可用于目標(biāo)基因的特定階段表達(dá)研究。在該表達(dá)體系的應(yīng)用方面,本文成功構(gòu)建了環(huán)丙烷脂肪酸合成酶編碼基因cfa回補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒 pBBRAPlcfa、pBBRAP2cfa 以及 pBBRAP3cfa,為進(jìn)一步研究環(huán)丙烷脂肪酸在醋酸菌耐酸過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。巴氏醋桿菌表達(dá)體系的構(gòu)建與優(yōu)化為后續(xù)研究特定功能基因提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),為醋酸菌耐酸機(jī)制的進(jìn)一步揭示,特別是為耐酸蛋白表達(dá)時(shí)間圖譜的探索提供了有力保障。另外本研究的開(kāi)展有助于進(jìn)一步揭示菌株Ab3高耐酸調(diào)控機(jī)制,同時(shí)也為其它醋酸菌的類似研究工作的開(kāi)展提供了思路,繼而對(duì)于高耐酸醋酸菌種的選育及醋酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化具有一定指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS201.3
【圖文】：

邐－？ＣＨ３ＣＨＯ邐ＣＨｊＣＯＯＨ逡逑圖１－１醋酸菌的代謝途徑逡逑Ｆｉｇ邋ｌ－ｌ邋Ｔｈｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｃ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ａｃｅｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂａｃｔｅｒｉａｔｈｅ逡逑醋酸中，有兩個(gè)屬里的大部分菌株能對(duì)乙酸進(jìn)行過(guò)氧化，分別是醋酸醋桿菌逡逑屬和葡糖醋桿菌屬，輔酶Ｑ為反應(yīng)的催化物。逡逑１．１．３醋酸菌的研究狀況逡逑醋酸菌的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值主要體現(xiàn)在發(fā)酵產(chǎn)酸，所以，隨著發(fā)酵產(chǎn)物的累積，逡逑發(fā)酵液也逐漸呈現(xiàn)為酸性。適當(dāng)?shù)乃釢舛扔欣诖姿峋纳L(zhǎng)與發(fā)酵，但當(dāng)酸積逡逑累到一定程度的時(shí)候，又會(huì)抑制醋酸菌的生長(zhǎng)與發(fā)酵。因此，醋酸菌的研究重點(diǎn)＇逡逑在于高耐酸和高產(chǎn)酸兩大特性上Ｃ后前／針對(duì)高產(chǎn)截和氋耐酸的研宄生要在從三逡逑個(gè)方面：一、從工藝學(xué)層面出發(fā)，改進(jìn)醋酸菌發(fā)酵的工藝，優(yōu)化接種量、初始逡逑ｐＨ值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、碳源、培養(yǎng)基成分比例等，通過(guò)各種單因素影響、逡逑正交影響尋找最適合的條件

圖２－１質(zhì)粒提取流程圖逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｐｌａｓｍｉｄ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｆｌｏｗ邋ｃｈａｒｔ逡逑２．３．２．２瓊脂糖凝膠電泳法逡逑脂糖凝膠電泳法流程圖見(jiàn)圖２－２。逡逑１９逡逑

圖２－２瓊脂糖凝膠電泳法流程圖逡逑Ｆｉｇ邋２－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｆｌｏｗ邋ｃｈａｒｔ逡逑２．３．２．３氨芐青霉素抗性基因的高保真ＰＣＲ克隆逡逑氨芐青霉素抗性基因的克隆以質(zhì)粒ｐＵＧ６為模板，引物見(jiàn)２．２．４章節(jié)，逡逑根據(jù)實(shí)際電泳顯示的ＰＣＲ條帶調(diào)整退火溫度，得到目的基因的克隆片段后，通逡逑過(guò)基因測(cè)序來(lái)檢測(cè)目的基因的完整性和準(zhǔn)確性。ＪＡ／Ｐ的ＰＣＲ體系（５０邋ｐＬ）及程逡逑序如下：逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 陽(yáng)飛;覃凌云;張華山;蘇正定;;醋酸菌分類及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];中國(guó)調(diào)味品;2015年10期

2 鄭妍;隋勇;;醋酸菌耐酸機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)釀造;2014年07期

3 徐友強(qiáng);馬翠卿;陶飛;許平;;細(xì)菌啟動(dòng)子識(shí)別及應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年10期

4 馮靜;施慶珊;歐陽(yáng)友生;陳儀本;;醋酸菌多相分類研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報(bào);2009年09期

5 吳沛橋;巴曉革;胡海;趙靜;;綠色熒光蛋白GFP的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J];生物醫(yī)學(xué)工程研究;2009年01期

6 劉曉棟;佘躍惠;張鴻翼;;醋酸菌培養(yǎng)條件研究[J];化學(xué)工程師;2007年01期

7 韋曉明,蘇明權(quán),楊安鋼,趙晶,溫偉紅,郝曉柯;電轉(zhuǎn)化條件對(duì)大腸桿菌XL1-Blue菌株轉(zhuǎn)化效率的影響[J];生物技術(shù)通訊;2003年06期

本文編號(hào)：2759502