【摘要】：表乳糖(Epilactose)是一種由D-半乳糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵和D-甘露糖連接而成的稀有二糖,其與乳糖和乳果糖互為同分異構(gòu)體。表乳糖能夠促進(jìn)大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌的增殖,具有較好的益生元潛力。雙歧桿菌(Bifidobacterium)是(母乳喂養(yǎng))健康嬰兒胃腸道中最早定殖且占主導(dǎo)地位的益生菌,具有抑制腸道病原菌、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等諸多益生活性。產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)作為畜禽養(yǎng)殖動(dòng)物腸道中的常見(jiàn)致病菌,可引起動(dòng)物腸道疾病,導(dǎo)致食品安全問(wèn)題,因而亟須對(duì)其進(jìn)行有效控制。因此,本文將表乳糖這一稀有二糖用于雙歧桿菌的增殖和產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物控制等研究領(lǐng)域中,旨在探究表乳糖對(duì)雙歧桿菌的益生功效及益生機(jī)制,深入開(kāi)發(fā)了表乳糖的益生潛力,對(duì)維護(hù)腸道健康控制腸道疾病等具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文利用酶法轉(zhuǎn)化乳糖制備表乳糖,在本室原有的制備工藝基礎(chǔ)上,依據(jù)表乳糖與乳糖的溶解度特性,從反應(yīng)體系中析出并移除了未反應(yīng)的乳糖,大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)室制備高純度表乳糖的步驟,并為后續(xù)研究提供了足量的表乳糖樣品。本文分別在以表乳糖及其同分異構(gòu)體乳糖或乳果糖為碳源的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)了8種雙歧桿菌,并對(duì)其增殖狀況進(jìn)行了評(píng)價(jià)。還將長(zhǎng)雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌置于以表乳糖、乳糖或乳果糖為碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng),通過(guò)菌落計(jì)數(shù)的方式測(cè)定兩菌的生長(zhǎng)狀況,并且,通過(guò)牛津杯法測(cè)定了長(zhǎng)雙歧桿菌分別在表乳糖、乳糖和乳果糖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)上清液對(duì)9種致病菌的抑菌活性,以探討表乳糖和長(zhǎng)雙歧桿菌的聯(lián)合抑菌效果。本文還分析了短雙歧桿菌在表乳糖、半乳糖和甘露糖培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),以闡明表乳糖在短雙歧桿菌中的代謝途徑及益生機(jī)制。結(jié)果表明,使用優(yōu)化后的表乳糖制備工藝,最終獲得了純度≥98%的表乳糖作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)原料。8種雙歧桿菌的培養(yǎng)結(jié)果表明,4株來(lái)源于人體腸道的長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙岐桿菌、短雙岐桿菌、青春雙岐桿菌均可有效利用表乳糖進(jìn)行增殖。在以表乳糖及其同分異構(gòu)體為碳源的共培養(yǎng)體系中,產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)明顯受到了長(zhǎng)雙歧桿菌的抑制,并且表乳糖在提高長(zhǎng)雙歧桿菌的存活率方面具有顯著作用。牛津杯法測(cè)定表明,抑菌作用與長(zhǎng)雙歧桿菌培養(yǎng)上清液中的抑菌物質(zhì)有關(guān)。短雙岐桿菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,短雙歧桿菌表達(dá)了3種可水解β-1,4糖苷鍵的同工酶,表達(dá)了4個(gè)主要參與表乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,推測(cè)表乳糖通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入菌體后,可被水解成半乳糖和甘露糖為菌體提供能量,此外,表乳糖還對(duì)短雙歧桿菌的乳酸、嘌呤核苷酸、氨基酸、葉酸以及肽聚糖等生物合成途徑,以及代謝產(chǎn)物的跨膜運(yùn)輸過(guò)程具有促進(jìn)作用。本文不僅評(píng)價(jià)了表乳糖對(duì)于增殖雙歧桿菌和抑制病原菌的益生功效,還從雙歧桿菌代謝途徑上的基因表達(dá)角度,揭示了表乳糖體現(xiàn)其益生功效的內(nèi)在機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS201.3
【圖文】：

乳糖(Lactose，4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖)和乳果糖(Lactulose，4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)互為同分異構(gòu)體。圖1.1 表乳糖分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1.1 The structure of epilactose1.1.1 表乳糖的制備表乳糖最早是由 Bergman 等在 1923 年化學(xué)合成乳糖時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)中間產(chǎn)物(Schlenk et al.,1928)，因其多羥基結(jié)構(gòu)使得化學(xué)合成制備表乳糖的路徑較繁瑣，通常需要經(jīng)過(guò) 7 步反應(yīng)才能完成(Haskins et al., 2002)。Tyler 等在 1967 年發(fā)現(xiàn)，白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus 7)能夠?qū)⒗w維二糖還原端的葡萄糖 C-2 位的羥基異構(gòu)化，生成葡甘露二糖(4-O-β-D-glucopyranosy-1-D-mannose)(Tyler et al., 1967)，但他們并沒(méi)有嘗試將該酶用于制備表乳糖。直到 2008 年，Ito 等利用大腸桿菌異源表達(dá)纖維二糖差向異構(gòu)酶基因，并利用該酶成功將乳糖轉(zhuǎn)化為表乳糖(Ito et al., 2008)，自此以后

12圖 2.1 乳糖異構(gòu)化 TLC 檢LC detection of isomerizatio品；2：表乳糖標(biāo)品；3： 2.2 C 所示。圖譜顯示考標(biāo)準(zhǔn)品圖譜 2.2A 及確定圖 2.2 C 中峰 1 為成率為 14.93%(w/w)。

2.4.2.1 乳糖結(jié)晶將酶法制備后的反應(yīng)產(chǎn)物濃縮至原體積的60%(v/v)，置于4℃使乳糖結(jié)晶，離心去除結(jié)晶后，將剩余上清液通過(guò)HPLC檢測(cè)，結(jié)果如圖2.3 C所示，峰1為表乳糖，峰2為乳糖。與圖2.2 C的異構(gòu)化產(chǎn)物相比，去除結(jié)晶后，反應(yīng)溶液中乳糖的相對(duì)比例下降，表乳糖的相對(duì)比例上升，表明反應(yīng)溶液中的大部分乳糖得到了有效移除。通過(guò)面積歸一化法分別計(jì)算去除結(jié)晶后的溶液中表乳糖及21

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本文編號(hào)：2751178