【摘要】：表乳糖(Epilactose)是一種由D-半乳糖通過β-1,4糖苷鍵和D-甘露糖連接而成的稀有二糖,其與乳糖和乳果糖互為同分異構體。表乳糖能夠促進大鼠腸道內雙歧桿菌和乳桿菌的增殖,具有較好的益生元潛力。雙歧桿菌(Bifidobacterium)是(母乳喂養(yǎng))健康嬰兒胃腸道中最早定殖且占主導地位的益生菌,具有抑制腸道病原菌、調節(jié)腸道菌群結構等諸多益生活性。產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)作為畜禽養(yǎng)殖動物腸道中的常見致病菌,可引起動物腸道疾病,導致食品安全問題,因而亟須對其進行有效控制。因此,本文將表乳糖這一稀有二糖用于雙歧桿菌的增殖和產氣莢膜梭菌的生物控制等研究領域中,旨在探究表乳糖對雙歧桿菌的益生功效及益生機制,深入開發(fā)了表乳糖的益生潛力,對維護腸道健康控制腸道疾病等具有重要的現(xiàn)實意義。本文利用酶法轉化乳糖制備表乳糖,在本室原有的制備工藝基礎上,依據表乳糖與乳糖的溶解度特性,從反應體系中析出并移除了未反應的乳糖,大大簡化了實驗室制備高純度表乳糖的步驟,并為后續(xù)研究提供了足量的表乳糖樣品。本文分別在以表乳糖及其同分異構體乳糖或乳果糖為碳源的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)了8種雙歧桿菌,并對其增殖狀況進行了評價。還將長雙歧桿菌和產氣莢膜梭菌置于以表乳糖、乳糖或乳果糖為碳源的培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng),通過菌落計數的方式測定兩菌的生長狀況,并且,通過牛津杯法測定了長雙歧桿菌分別在表乳糖、乳糖和乳果糖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)上清液對9種致病菌的抑菌活性,以探討表乳糖和長雙歧桿菌的聯(lián)合抑菌效果。本文還分析了短雙歧桿菌在表乳糖、半乳糖和甘露糖培養(yǎng)基中的轉錄組數據,以闡明表乳糖在短雙歧桿菌中的代謝途徑及益生機制。結果表明,使用優(yōu)化后的表乳糖制備工藝,最終獲得了純度≥98%的表乳糖作為后續(xù)實驗原料。8種雙歧桿菌的培養(yǎng)結果表明,4株來源于人體腸道的長雙歧桿菌、嬰兒雙岐桿菌、短雙岐桿菌、青春雙岐桿菌均可有效利用表乳糖進行增殖。在以表乳糖及其同分異構體為碳源的共培養(yǎng)體系中,產氣莢膜梭菌的生長明顯受到了長雙歧桿菌的抑制,并且表乳糖在提高長雙歧桿菌的存活率方面具有顯著作用。牛津杯法測定表明,抑菌作用與長雙歧桿菌培養(yǎng)上清液中的抑菌物質有關。短雙岐桿菌轉錄組數據分析結果表明,短雙歧桿菌表達了3種可水解β-1,4糖苷鍵的同工酶,表達了4個主要參與表乳糖轉運過程的轉運蛋白,推測表乳糖通過轉運系統(tǒng)進入菌體后,可被水解成半乳糖和甘露糖為菌體提供能量,此外,表乳糖還對短雙歧桿菌的乳酸、嘌呤核苷酸、氨基酸、葉酸以及肽聚糖等生物合成途徑,以及代謝產物的跨膜運輸過程具有促進作用。本文不僅評價了表乳糖對于增殖雙歧桿菌和抑制病原菌的益生功效,還從雙歧桿菌代謝途徑上的基因表達角度,揭示了表乳糖體現(xiàn)其益生功效的內在機制。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.3
【圖文】：

乳糖(Lactose，4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖)和乳果糖(Lactulose，4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)互為同分異構體。圖1.1 表乳糖分子結構式Fig. 1.1 The structure of epilactose1.1.1 表乳糖的制備表乳糖最早是由 Bergman 等在 1923 年化學合成乳糖時發(fā)現(xiàn)的一個中間產物(Schlenk et al.,1928)，因其多羥基結構使得化學合成制備表乳糖的路徑較繁瑣，通常需要經過 7 步反應才能完成(Haskins et al., 2002)。Tyler 等在 1967 年發(fā)現(xiàn)，白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus 7)能夠將纖維二糖還原端的葡萄糖 C-2 位的羥基異構化，生成葡甘露二糖(4-O-β-D-glucopyranosy-1-D-mannose)(Tyler et al., 1967)，但他們并沒有嘗試將該酶用于制備表乳糖。直到 2008 年，Ito 等利用大腸桿菌異源表達纖維二糖差向異構酶基因，并利用該酶成功將乳糖轉化為表乳糖(Ito et al., 2008)，自此以后

12圖 2.1 乳糖異構化 TLC 檢LC detection of isomerizatio品；2：表乳糖標品；3： 2.2 C 所示。圖譜顯示考標準品圖譜 2.2A 及確定圖 2.2 C 中峰 1 為成率為 14.93%(w/w)。

2.4.2.1 乳糖結晶將酶法制備后的反應產物濃縮至原體積的60%(v/v)，置于4℃使乳糖結晶，離心去除結晶后，將剩余上清液通過HPLC檢測，結果如圖2.3 C所示，峰1為表乳糖，峰2為乳糖。與圖2.2 C的異構化產物相比，去除結晶后，反應溶液中乳糖的相對比例下降，表乳糖的相對比例上升，表明反應溶液中的大部分乳糖得到了有效移除。通過面積歸一化法分別計算去除結晶后的溶液中表乳糖及21

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