發(fā)布時(shí)間：2020-07-06 15:54

【摘要】：南極洲位于地球南端,四周被三大洋包圍,與其他大陸隔離,獨(dú)特的地理位置造就了其獨(dú)特的氣候。酷寒、干燥、烈風(fēng)和強(qiáng)紫外輻射等制約了陸生植物的生長(zhǎng)發(fā)育。苔蘚植物(Bryophyte)是南極大陸主要植被類群。黃酮類化合物是植物體內(nèi)最大的一類次生代謝物,參與植物生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)非生物脅迫。盡管類黃酮代謝途徑在很多植物中得到了很好的研究,但在高等植物的低等類群中的研究卻很少。目前,地錢(qián)查爾酮異構(gòu)酶、小立碗蘚查爾酮合酶和鈍磷紫背苔黃酮合酶等少數(shù)基因被報(bào)道。2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase,2-ODD)是植物基因組中第二大酶家族,參與各種氧合/羥化反應(yīng),在植物和動(dòng)物發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、核酸修飾/修復(fù)和次級(jí)代謝合成途徑中發(fā)揮重要作用。類黃酮代謝途徑中的2-ODD家族基因也為豐富的黃酮類化合物形成提供保障。本文從南極黃絲瓜蘚(Pohlia nutans)轉(zhuǎn)錄組中選取了一個(gè)高度響應(yīng)UV-B的基因。生物信息學(xué)分析為類黃酮代謝途徑關(guān)鍵2-ODD家族基因,命名為PnODDl(Pohlia nutan2 2-ODD1),并對(duì)其進(jìn)行了克隆分析和功能研究。具體結(jié)果如下:1.強(qiáng)紫外輻射(UV-B)對(duì)南極黃絲瓜蘚與新疆地區(qū)泛生絲瓜蘚的影響本課題組研究發(fā)現(xiàn),與山東地區(qū)的卵蒴絲瓜蘚(Pohlia proligera)相比,南極黃絲瓜蘚對(duì)紫外輻射的耐受性高,且這種抗性與黃酮類化合物相關(guān)。本文進(jìn)一步研究了南極黃絲瓜蘚與新疆泛生絲瓜蘚(Pohlia cruda)對(duì)紫外輻射響應(yīng)的差異。UV-B(70μW/cm2)輻射處理12h后,新疆泛生絲瓜蘚植株出現(xiàn)彎曲和蓬亂、葉片皺縮、顏色變暗,部分植株頂端枯死,受損傷嚴(yán)重;而南極黃絲瓜蘚僅有顏色變化,生長(zhǎng)狀態(tài)較好。與新疆泛生絲瓜蘚相比,UV-B處理后南極黃絲瓜蘚的活性氧自由基和丙二醛含量水平增幅較小,但卻積累了更多的黃酮類化合物。同時(shí),UV-B處理后,兩種抗氧化酶在兩種苔蘚體內(nèi)活性均顯著提高,但是南極黃絲瓜蘚抗氧化酶的提升幅度小于新疆泛生絲瓜蘚。以上結(jié)果表明,南極黃絲瓜蘚對(duì)紫外輻射的抗性較新疆泛生絲瓜蘚強(qiáng),這種抗性主要依賴于體內(nèi)合成的大量黃酮類物質(zhì)。2.南極黃絲瓜蘚PnODD1的克隆、表達(dá)分析和功能研究從南極黃絲瓜蘚轉(zhuǎn)錄組中選取了一個(gè)高度響應(yīng)UV-B的基因,對(duì)其進(jìn)行了克隆、表達(dá)分析和功能研究。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該基因?qū)儆陬慄S酮代謝途徑的2-ODD家族成員(PnODD1)。同時(shí),疑是類無(wú)色花青素雙加氧酶(LDOX/ANS-like)基因。PnODD1大小為1510 bp,含有一個(gè)1050 bp的ORF,編碼346個(gè)氨基酸,蛋白分子量為38.4 kDa。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),PnODDl與其它2-ODD超家族基因的序列相似性為39.5-48.9%,具有典型N端保守的DIOX_N結(jié)構(gòu)域和2-OD-FeⅡ_Oxy結(jié)構(gòu)域;另外,與其它2-ODD一樣,存在Fe2+結(jié)合位點(diǎn)殘基(His219、Asp221 and His275)和AKG(2-酮戊二酸)結(jié)合位點(diǎn)殘基(Tyr204、His219、Asp221、His275、Arg285和Ser287)。通過(guò)SWISS-MODEL進(jìn)行了同源建模,空間結(jié)構(gòu)顯示,PnODD1蛋白由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲三者在中央部位構(gòu)成一個(gè)空腔,即為鐵離子(Fe2+)結(jié)合位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),PnODD1與其他物種2-ODDs基于保守的結(jié)構(gòu)和序列特征(如氨基酸同源性和保守基序)而共享一個(gè)共同的進(jìn)化祖先;與鈍磷紫背苔FNSI類聚同一分支,表明了二者具有很近的親緣關(guān)系。通過(guò)生信在線預(yù)測(cè)以及PEG-CaCl2法介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體的實(shí)驗(yàn),研究了蛋白的亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示PnODD1主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。利用RT-qPCR技術(shù)分析了PnDD1基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)。結(jié)果表明,PnODD1基因在D-Mannitol、UV-B、鹽脅迫下均顯著上調(diào)表達(dá),說(shuō)明其參與南極黃絲瓜蘚適應(yīng)環(huán)境脅迫。將PnODD1基因在擬南芥中組成型表達(dá),研究了其生物學(xué)功能。正常生長(zhǎng)狀態(tài)下,過(guò)表達(dá)PnODD1對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有影響。過(guò)表達(dá)PnODD1增強(qiáng)了擬南芥對(duì)鹽脅迫的抗性。在125mMNaCl脅迫下,Col-0、AtOE1和AtOE2種子萌發(fā)率分別是46.7%、91.7%和 86.7%;150 mM NaCl 脅迫下 Col-O、AtOE1 和AtOE2種子萌發(fā)率分別是35.0%、71.6%和75.3%;根長(zhǎng)研究發(fā)現(xiàn),在125mM或150mMNaCl處理下,過(guò)表達(dá)PnODD1擬南芥主根均顯著長(zhǎng)于野生型擬南芥。同時(shí),過(guò)表達(dá)PnODD1增強(qiáng)了擬南芥對(duì)滲透脅迫的抗性。在0.1 M或0.3 M D-甘露醇處理后,過(guò)表達(dá)PnODD1擬南芥的種子萌發(fā)率、主根長(zhǎng)度、植株鮮重以及側(cè)根數(shù)目均顯著高于野生型擬南芥。UV-B處理12h后,野生型擬南芥生長(zhǎng)受到了明顯的抑制,莖稈細(xì)小、葉片蜷皺和葉片表面積變小;過(guò)表達(dá)PnODD1緩解了UV-B對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。逆境條件會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)脫落酸(Abscisic acid,ABA)水平急劇升高,其抑制種子萌發(fā),影響植物生長(zhǎng)。過(guò)表達(dá)PnODD1降低了擬南芥對(duì)ABA的敏感性。1.0μMABA處理下,AtOE1和AtOE2種子萌發(fā)數(shù)分別是93.3%和91.7%,顯著高于野生型的85.3%,過(guò)表達(dá)系的主根長(zhǎng)度約為野生型的1.30倍。擬南芥總黃酮代謝譜分析發(fā)現(xiàn),PnODD1影響了非生物脅迫下擬南芥體內(nèi)黃酮類化合物的種類和含量。另外,滲透脅迫下,PnODD1通過(guò)影響干旱響應(yīng)基因(P5CS1和AtKIN1)及ABA信號(hào)途徑相關(guān)基因(AtABF3、AtMYB2、AtRD22和AtDDEB2A)的表達(dá),增強(qiáng)了過(guò)表達(dá)擬南芥的抗旱性。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體,對(duì)PnODD1基因進(jìn)行異源表達(dá)并優(yōu)化了表達(dá)條件,確定了在誘導(dǎo)溫度16℃、IPTG濃度0.11mM和誘導(dǎo)時(shí)間24h條件下重組蛋白表達(dá)量最高;利用HLPC進(jìn)行了重組蛋白與多種底物的產(chǎn)物分析,發(fā)現(xiàn)PnODD1蛋白可以催化柚皮素(Naringenin,NAR)生成新化合物。體外NAR給養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)PnODD1緩解了NAR對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用。綜上所述,PnODD1通過(guò)影響擬南芥體內(nèi)黃酮類化合物含量和脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá),增強(qiáng)了植株對(duì)非生物脅迫的抗性,為揭示苔蘚適應(yīng)極地環(huán)境的特殊機(jī)制提供了重要參考,豐富了南極植物基因資源。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2;Q945.78
【圖文】：

物活性氧（Ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｎ邋ｓｐｅｃｉｅｓ，邋ＲＯＳ）的水平增加，與此同時(shí)，植物會(huì)誘導(dǎo)合逡逑成體內(nèi)酚類和黃酮類化合物，以保護(hù)機(jī)體免受傷害。黃酮類化合物參與植物對(duì)生逡逑物和非生物脅迫的響應(yīng)如圖１－１所示。逡逑植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遭受昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)、真菌、原生生物、細(xì)菌和病毒的逡逑侵害，這個(gè)過(guò)程稱為生物脅迫，是農(nóng)業(yè)上農(nóng)作物損失的首要問(wèn)題（Ｂａｓｋａｒ以《／．，逡逑２０１２）。當(dāng)病原體或害蟲(chóng)感染植物時(shí)，誘導(dǎo)植物黃酮類化合物合成（Ｂａｒｒｙ邋ｅ／邋ａ／．，逡逑２００２；邋Ｇａｌｌｅｔ以ａ／．，邋２００４）。在水稻中，發(fā)現(xiàn)了三種抑制昆蟲(chóng)消化并有褐飛虱的威懾逡逑作用的黃酮糖苷（Ｈａｒｂｏｍｅ邋ｄａ／．，邋２０００）。煙草中的蘆丁和槲皮素通過(guò)抑制害蟲(chóng)蟲(chóng)逡逑卵正常發(fā)育，導(dǎo)致害蟲(chóng)存活率降低�；ㄉ虚纹に睾吞J丁糖苷的含量與煙草粘蟲(chóng)逡逑（斜紋夜蛾）的死亡率增加有關(guān)（Ｍａｌｌｉｋａｒｊｕｎａ＾ａ／．，２００４）。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)棉花葉片逡逑表皮組織中的花青素積累會(huì)增加機(jī)體對(duì)野油菜黃單胞菌（沿ｗＡｏｍｏｎａｙ逡逑ｐｖ．邋ｍｏ／ｖａｃｅａｒａｗ）的抗性（Ｋａｎｇａｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ邋ｅｆ邋ａ／”邋２００２）。逡逑干旱、強(qiáng)紫外輻射、重金屬超標(biāo)、高鹽和高低溫等對(duì)植物生長(zhǎng)造成了脅迫，逡逑這些因素稱為非生物脅迫。當(dāng)植物暴露于非生物脅迫時(shí)

１．３．１類黃酬代謝途徑概述逡逑類黃酮代謝途徑是植物次級(jí)代謝系統(tǒng)中研究最多的途徑之一，它也是苯丙烷逡逑代謝途徑的分支。其合成過(guò)程和關(guān)鍵基因如圖１－２所示。苯丙氨酸在苯丙氨酸裂逡逑解酶邋（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ邋ａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ，邋ＰＡＬ）、肉桂酸輕化酶逡逑（Ｃｉｎｎａｍａｔｅ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｃ４Ｈ）和邋４－香豆輔酶邋Ａ邋連接酶（４－Ｃｏｕｍａｒｏｙｌ：ＣｏＡ－ｌｉｇａｓｅ，逡逑４ＣＬ）的作用下合成了類黃酮代謝途徑的前體化合物４－香豆酰輔酶Ａ，它與三分逡逑子N!二酰輔酶Ａ在查爾酮合成酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＨＳ，邋ＥＣ２．３．１．７４）催化下進(jìn)逡逑行縮合，形成中間體－柚皮素查爾酮（Ｖｅｒｖｅｒｉｄｉｓ邋ｅＭ／．，２００７；邋Ｍｉｒａｎｄａ邋Ｗ邋ａ／．，邋２０１２）；逡逑此外，查爾酮還原酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，邋ＣＨＲ）與ＣＨＳ共同催化產(chǎn)生６＇－脫氧查逡逑爾酮，而后查爾酮異構(gòu)酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＣＨＩ，邋ＥＣ５．５．１．６）催化查爾酮環(huán)化成逡逑相應(yīng)的（２Ｓ）－黃烷酮（柚皮素）

３．１．１邋ＵＶ－Ｂ處理對(duì)苔蘚長(zhǎng)勢(shì)和總黃酮代謝譜的影響逡逑自１９８０ｓ以來(lái)，氟利昂等物質(zhì)的使用使地球的臭氧層變薄甚至造成空洞，到逡逑達(dá)南極大陸的紫外線急劇增多，導(dǎo)致當(dāng)?shù)刂参锉┞对趶?qiáng)烈的紫外輻射下。課題組逡逑研究發(fā)現(xiàn)，與常溫卵蒴絲瓜蘚ＣＰｏＷ／ａ／？ｒａ／／ｇｅｒａ，來(lái)源山東）相比，南極黃絲瓜蘚逡逑具有更強(qiáng)的抗紫外輻射能力（王太林，２０１７）。為了進(jìn)一步比較南極黃絲瓜蘚與逡逑常溫苔蘚對(duì)強(qiáng)紫外輻射的抗性差異，我們選擇了另一種源于新疆的泛生絲瓜蘚逡逑作為對(duì)象。分析了高強(qiáng)度ＵＶ－Ｂ處理對(duì)兩種苔蘚表觀形態(tài)和黃酮類逡逑化合物代謝譜的影響。逡逑正常培養(yǎng)條件下，兩株苔蘚莖葉體翠綠、莖桿豎直，生長(zhǎng)狀態(tài)較好（圖３－１邋ａ逡逑和ｃ）。將兩組材料置于ＵＶ－Ｂ邋（７０邋ｊａＷ／ｃｍ２）轄射箱中處理１２邋ｈ后，新疆泛生絲瓜逡逑蘚植株出現(xiàn)蜷縮、蓬亂的狀態(tài)，頂端葉片干枯、彎曲；而南極黃絲瓜蘚僅植株顏逡逑色略微變黃，生長(zhǎng)狀態(tài)較好（圖３－１邋ａ和ｄ）。逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＵＶ－Ｂ邋（７０邋ｊｉＷ／ｃｍ２）逡逑

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 姚行浩;南極黃絲瓜蘚（Pohlia nutans）2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶基因PnODD1在植物抗逆中的作用[D];山東大學(xué);2019年

2 李程程;南極黃絲瓜蘚（Pohlia nutans）對(duì)強(qiáng)紫外輻射的響應(yīng)及其黃烷酮3-羥化酶的功能分析[D];山東大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2743841